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一种快速,敏感的RPA测定,用于检测海鲜的伞菌溶血溶血

云云博士 柯特兰博士 刘博士 肖夏博士太阳 宝华博士赵博士 王建昌博士

成功的发展,测试显示了其他行业的承诺

 颤音
该扫描电子显微照片(SEM)描绘了许多血管乙酰氨基溶素(Mag.19058X),海鲜和其他食品行业的严重病原体。由CDC / Janice Carr照片公共区域。

细菌 颤音 Parahaemolyticus. 自然存在于咸水沿海环境中,经常从各种海鲜上隔离。这种细菌是一种主要的海鲜传播的病原体,导致胃肠疾病导致毒性或未煮熟的海鲜IT污染物。近年来,爆发了 V. Parahaemolyticus. 许多国家都是感染是一个重要的公共卫生问题。此外,数量 V. Parahaemolyticus. 感染有所增加,近年来,他们的覆盖范围全球扩大。

人们感染了 V. Parahaemolyticus. 以急性胃肠炎障碍为特征,具有腹泻,头痛和呕吐的临床迹象。被感染的低免疫群体 V. Parahaemolyticus. 可能在严重的情况下开发败血症。控制金额 V. Parahaemolyticus. 在海鲜中是一种有效的方法来预防该病原体感染;因此,确定的水平是重要的 V. Parahaemolyticus. in seafood.

早期和快速诊断对于管理来说至关重要 V. Parahaemolyticus. 感染。不同的诊断方法 V. Parahaemolyticus. 已报告感染。常规培养和免疫学方法是用于的常用技术 V. Parahaemolyticus. 检测。但是,它们是耗时的,需要几天时间来提供众多分析步骤后提供确认的结果。

生物技术的进步导致了许多基于基因扩增的分子检测技术的发展 V. Parahaemolyticus.,具有不同程度的敏感性和特异性。这些包括聚合酶链反应(PCR)和其他。然而,由于所需的昂贵仪器,这些测试对于现场应用可能是不切实际的。需要简单,快速,准确和用户友好的平台,需要早期的需求(POD)检测 V. Parahaemolyticus. infection.

重组酶聚合酶扩增(RPA),一种新型等温基因扩增技术,已被证明是一种简单,快速,特异性,敏感的和成本效益的分子测定,以确定各种病原体。靶序列的指数扩增的RPA方法可以在20分钟或更短的时间内实现。

本文 - 改编和总结了 原始出版物 [Geng,Y.等人。 2019年,对海鲜血糖渣溶血溶血性的快速敏感RPA测定的开发和评价。 BMC Microbiol 19,186(2019) - 描述了一种用于开发和评估实时RPA方法的研究,以便简单且快速地检测 V. Parahaemolyticus..

研究设置

共有五个 V. Parahaemolyticus. 菌株,五种其他弧菌物种和22种其他细菌菌株用于确定实时RPA的特异性。有关细菌菌株及其DNA提取的详细信息; RPA引物和探针;实时RPA反应;实时PCR V. Parahaemolyticus.;特异性和分析敏感性分析;用人为污染样品进行评估;和统计方法使用,请参阅原始出版物。

这项工作得到了河北省大学科学研究基金会(河北省QN2019025)的支持;中华人民共和国质量监督,检验检疫总局(2016ik107);河北师范大学生物博士学博士(河北183717)。

结果和讨论

实时RPA反应成功在38摄氏度下进行,并在20分钟内得到结果。仅检测到该方法 V. Parahaemolyticus. 并且没有显示与其他细菌的交叉反应,表现出高度的特异性。该研究表明,实时RPA的检测限(LOD)为1.02×102 copies/reaction.

对于具有不同细菌浓度的人工污染样品, V. Parahaemolyticus. 通过在牡蛎酱中的实时RPA,浓度为低至4个菌落形成单位(CFU)/ 25g,1 cfu / 25克和7个CFU / 25克,可以在5至12分钟内检测到5至12分钟内检测到5至12分钟内。分别在富集6小时后,通过实时PCR [在27和32之间的CT(循环阈值)值至少为35分钟。在实时PCR测定中,通过荧光信号积累来检测阳性反应。 CT荧光信号越过阈值所需的周期数,超过背景电平。

近年来,食品传播病原体引起的疾病已成为一个重要的全球公共卫生问题。 V. Parahaemolyticus. 是导致食品疾病的主要病原体之一,并具有这种病原体的食品污染已成为食品安全的重要关注。因此,需要快速,具体且可靠的诊断技术,可以有效地用于更好地检测 V. Parahaemolyticus. 在海鲜,环境和其他各种样品类型。

在我们的研究中,我们成功地建立了靶向特定基因的实时RPA测定 V. Parahaemolyticus。 常规的RPA在38度-c成功进行,并在20分钟内完成。使用连续稀释液检查实时RPA测定的敏感性 V. Parahaemolyticus. 基因组DNA模板。实时RPA测定的检测限为102份/反应。

虽然这一点 V. Parahaemolyticus. 通过实时RPA的检测结果可以在大约30分钟内获得,包括核酸提取的时间,阳性样品的反应时间在使用实时PCR时达到1小时。此外,实时RPA测定在检测人工污染的海鲜样品中也是成功的,并且它比检测速度的实时PCR更好地进行。

对于本研究中描述的实时RPA测定, V. Parahaemolyticus. 可以在12分钟内以低至1 cfu / 25克的浓度在人工污染的样品中检测。与其他等温扩增技术相比,RPA不需要初始加热进行DNA变性,并且可以在不到12分钟内获得的结果,其不包括富集时间。实时RPA测定与其他DNA扩增方法具有多种优点,包括单个样品和其他样品的更快时间延时。

RPA已被广泛探索了不同病原体的分子检测,并且野外测试也已达到登革热病毒和禽流感感染。此外,在研究中使用的便携式管扫描仪,只有1.75千克的尺寸为25cm×16.5cm×8.5厘米,比大多数实时PCR机器更简单,可以在现场使用,在电池电量上运行全天。

透视

在这项研究中,我们成功开发了一种基于EXO探针的实时RPA方法,用于检测 V. Parahaemolyticus.。具有高敏感性和特异性,可以在20分钟内完成测定,并且该方法易于在临床环境中进行,而不需要精致的设备,这使其适用于检疫站,进口港口或爆发的港口。

本研究中开发的有效和快速的实时RPA测定将在监测中非常有用 V. Parahaemolyticus. 感染并有可能成为实时PCR和其他热量测试的其他等温方法的有希望的替代品 V. Parahaemolyticus. 感染,海鲜和其他行业的风险很大。


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