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评估熟,WSSV感染虾的传输风险

路易斯费尔南多阿兰肯卡罗,博士。 洪N. Mai,Ph.D. 琳达尼南,MSC 约书亚琳,BSC 布兰达崇高,BSC Arun K. Dhar.,Ph.D.

结果显示虾肉在沸腾后不传染1分钟

煮熟的虾
该研究评估了WSSV感染的太平洋白虾的传播风险,结果表明,沸腾后虾不感染至少1分钟。照片由Darryl Jory。

白斑疾病(WSD)是由白斑综合征病毒(WSSV)引起的,是养殖虾业的最大威胁之一。 WSD在几天内导致在成长条件下的特定病原体(SPF)群体中可以达到高达100%的瘦弱。 WSSV于1992年首次报道台湾。从那时起,日本,韩国,东南亚,南亚,地中海,中东,美洲和澳大利亚均报道了WSSV的虾感染。

WSSV.介绍的风险主要是由于受感染虾的生产和进口国之间的国际运动,无论它们是活着还是冻结 - 头部(HO),头部(HOSO)或无头壳上(HLSO) - 或作为煮熟的产品。由于通过商品产品无意中引入虾病原体的风险,一些国家 - 包括澳大利亚,沙特阿拉伯和其他国家 - 已经实施了严格的协议,规范了生虾和大虾产品的进口。确定一些病毒牙龈的存在和/或不存在的筛查是通过聚合酶链式反应(PCR)。通常,如果批次为阳性,则产品要么被破坏或处理(煮熟)。

最近,通过聚合酶链反应(PCR)对WSSV进行了阳性而感染的煮熟的虾。然而,没有研究以确定通过PCR测试阳性的熟虾中WSSV的感染性。已经发表的研究表明,冷冻虾产品于1995年介绍了WSSV介绍的大道,但只有少数同行评审出版物突出了熟食虾的WSSV感染性风险。然而,这些研究限制了它们对WSSV检测的结果通过PCR检测,如果含有DNA病毒序列的熟虾是感染的,它仍然未知。我们的研究目的 - 由亚利桑那大学的水产养殖病理实验室支持 - 是评估WSSV感染虾对烹饪时的感染性。

研究设置

该研究中的虾来自美国的商业虾设施。共有250个SPF太平洋白虾(Litopenaeus vannamei.)使用平均重量的10克。该样品重量代表南部在虾农场进行肠道农场时池塘中虾的典型重量,其中发生了疾病爆发即将发生疾病爆发。

为了产生WSSV感染的虾,通过通过先前证实的WSSV感染的WSSV感染的碎虾组织通过口服途径进行WSSV攻击试验。到SPF L. Vannamei。 这是在一天内分为两个口粮(早上和晚上)的SPF动物体重的10%。实验罐中的水保持在25 ppt盐度和25摄氏度的温度下。实验挑战后,每小时评估死亡率。 SPF. L. Vannamei. 被喂养健康组织并用作阴性对照。

一旦虾成本达到50%,就会移除存活的动物以模拟紧急收获和安乐死。收集鳃和Pleopods样品并保存用常规和实时PCR测定确认。固定五虾具有临床迹象,并保留组织学分析(图1)。

煮熟的虾
图1:研究的实验设计。

将最初的感染虾群分成六组,每虾40虾;将每组分配给0,1,3,5,10和30分钟的特定沸腾(淡水)时间。一组没有感染WSSV,是负面控制。每个40虾类组分为两个子组,每个子组每次重复。使用不同的时间框架(0,1,3,5,10和30分钟)煮沸亚组1,然后喂食SPF L. Vannamei.。亚组2也被用于不同的时间框架(0,1,3,5,10和30分钟),但在进料到SPF虾之前14天冷冻(减去-20度-C)(图2) 。

煮熟的虾
图。图2:本研究中使用的实验设计的示意图,包括在沸水中处理不同时间的WSSV感染的组织,然后在沸水中的不同时间进行治疗,然后是直接实验挑战或在冰箱中存放样品,然后在SPF进行实验挑战之前 L. Vannamei..

使用放置在尾部骨骼肌内的温度计收集虾组织的温度,在烹饪过程之前和之后收集内部温度数据。在沸腾后,将样品稍微冷却,然后收集鳃和Pleopod样品并保留用于PCR和QPCR的进一步分析(定量PCR是传统PCR的改进版本,用于检测和量化众多核酸应用程序)。

为了确定煮熟的虾的致病性,用SPF虾群进行挑战试验。每90升罐含有10个幼年(2至3克)。从每一帧的每次复制中,从所有虾切碎,包括胃,鳃和pleopods,包括胃,鳃和pleopods的虾组织。将切碎的组织添加到罐中,以两种口粮(早晚)以一天内活性SPF人群总体重的10%。挑战的持续时间为11至12天。记录日常死亡率,收集来自奇氏虾虾的鳃/玻璃池池,并保存用于通过QPCR和PCR检测WSSV检测。此外,奄奄一息的虾在戴维森的组织学分析中固定在戴维森的固定剂中。

最终累积存活率在挑战结束时确定。每个罐都会合并所有虾的Pleopods样品,并保存在95%的乙醇中用于QPCR和PCR分析。每个坦克的两只虾都在戴维森的组织学分析中固定在戴维森的固定剂中。使用与上述相同的方法用于两周(第2组)冷冻两周(第2组)进行了相似的WSSV感染攻击。

有关实验设计的详细信息;虾实验感染,采样和汇集,以及样品的沸腾; WSSV挑战测试; DNA提取; PCR和QPCR分析;和组织病理学,联系相应作者。

结果

将虾组织的WSSV感染虾组织添加到实验罐中,虾群10.5克±1克导致高死亡率。第一组虾开始在第2天发生感染后死亡(D.P.I)。在4 D.P.I上,当死亡率达到50%时,收获幸存者。戴维森的固定虾被PCR和H确认为WSSV呈阳性&E(血红素毒素和eosin染色,或h &E染色,是组织学中使用的主要组织污渍之一,研究生物组织的微观解剖学研究;见图1)。在挑战期间收集的三十虾在冰上保持,然后通过QPCR和嵌套的PCR对WSSV进行采样并确认阳性(旨在改善特异性和敏感性的PCR的修饰)。

将WSSV感染的虾暴露于不同的沸腾温度(0,1,3,5,10和30分钟)。在沸腾过程结束时,针对PCR和QPCR分析进行鳃和Pleopods的样品。表1总结了QPCR和嵌套的PCR对于WSSV而不冻结和冷冻两周。在为不同时间进行烹饪时收集的样品对QPCR进行了WSSV的阳性结果。相反,没有任何样品通过嵌套的PCR提供任何扩增。

Aranguren,煮熟的虾,表1A

坦克描述(没有冻结)QPCR WSSV - 否数正/否。全部的CT值 - 平均值±SD嵌套PCR WSSV - 否。正池/否。全部的
负面控制0/4没有检测到 n (0/1)
WSSV. 30分钟厨师4/421.48±3.05.n (0/1)
WSSV. 10分钟厨师4/418.44±0.61n (0/1)
WSSV. 5分钟厨师4/420.54±3.20.n (0/1)
WSSV. 3分钟厨师4/420.01±1.81.n (0/1)
WSSV. 1分钟厨师4/425.73±5.00n (0/1)
WSSV. 0 min cook(阳性控制)4/420.35±2.50阳性(1/1)
表1a。使用从暴露于不同沸点时间的虾样品中分离的DNA获得的QPCR和嵌套的PCR结果。

 

Aranguren,煮熟的虾,表1B

坦克描述(冻结2周)QPCR WSSV - 否数正/否。全部的CT值 - 平均值±SD嵌套PCR WSSV - 否。正池/否。全部的
负面控制0/4没有检测到 n (0/1)
WSSV. 30分钟厨师4/421.10±2.29n (0/1)
WSSV. 10分钟厨师4/421.22±1.30.n (0/1)
WSSV. 5分钟厨师4/422.99±2.15n (0/1)
WSSV. 3分钟厨师4/422.16±2.06n (0/1)
WSSV. 1分钟厨师4/420.65±1.03n (0/1)
WSSV. 0 min cook(阳性控制)4/421.34±2.63阳性(1/1)
表1B。使用从暴露于不同沸点时间的虾样品中分离的DNA获得的QPCR和嵌套的PCR结果。

 

在治疗组中,由WSSV感染并暴露于不同沸点时间的虾组织用作inoculum 每个OS 使用SPF挑战测试 L. Vannamei. 虾。表2总结了10 d.p.i后虾的存活率。

煮熟的虾
表2.使用WSSV煮沸组织作为接种物和SPF的实验挑战测试结果摘要 Litopenaeus vannamei..

在WSSV阳性控制(0分钟烹饪)罐中发现了高死亡率。 H&E和PCR在这些罐中确认了WSSV的存在。当煮沸的虾冷冻两周后获得类似的结果,然后用作传染性物质的来源。

为h收集的样品&分析了从实验结束时的不同治疗方法。在渗透细胞核中发现了WSSV肿瘤嗜碱性嗜碱性包涵体,在几种影响的外胚层和中胚层起源组织中发现。图。图3显示了来自阳性控制罐的胃部内皮中典型的WSSV组织学病变级4.0。相反,没有虾组织在沸腾时喂食不同时间(1,3,5,10和30分钟)显示出任何典型的WSSV的组织学病变。

通过QPCR进行实验感染的幼崽的样品在所有病例中通过QPCR测试阳性的阳性(表3)。

煮熟的虾
图3:H&虾的组织病理学 L. Vannamei. 在煮沸后用WSSV感染的组织进行实验感染。答:用WSSV阳性组织喂食1分钟的虾。 B:虾在没有沸腾的情况下用WSSV阳性组织(0分钟,阳性对照); C:用WSSV阳性组织喂养的虾煮沸1分钟并冷冻2周; D:用WSSV阳性组织喂食而不沸腾(0分钟)并冷冻2周(阳性对照)的虾。

Aranguren,煮熟的虾,表3

坦克描述WSSV.感染的虾在不同的时间煮熟QPCR WSSV - 否数正/否。全部的CT值 - 平均值±SD
与SPF虾挑战SPF虾挑战负面控制0/4n
与WSSV感染虾煮熟30分钟的SPF虾挑战与WSSV 30分钟烹饪虾的SPF挑战0/4n
与WSSV感染虾煮熟10分钟的SPF虾挑战WSSV. 10分钟厨师0/4n
与WSSV感染虾煮熟5分钟的SPF虾挑战 WSSV. 5分钟厨师0/4n
与WSSV感染虾煮熟3分钟的SPF虾挑战WSSV. 3分钟厨师0/4n
与WSSV感染虾煮熟1分钟的SPF虾挑战WSSV. 1分钟厨师0/4n
与WSSV感染虾煮熟0分钟的SPF虾挑战WSSV.阳性控制(0分钟。厨师)4/421.57±1.73.
表3. QPCR概述导致SPF虾有挑战WSSV感染的虾暴露于不同沸点时间。

 

讨论

我们的结果证明,WSSV感染的虾暴露于沸腾温度的时间,从1至30分钟的范围内没有传染性。 QPCR数据证实存在在暴露于不同沸点时间的所有样品中的WSSV DNA,并且发现了CT(循环阈值,当可以在背景信号上方检测到PCR产物的荧光时循环数)的显着差异在不同的沸腾时间(p<0.05)。然而,没有任何样品通过嵌套的PCR WSSV提供任何成功的扩增。

QPCR结果显示阳性结果,与嵌套的PCR相矛盾。从煮沸的虾中分离的WSSV DNA可能经历了显着的损伤,导致质量降低,而且分散于从新鲜收获的样品中分离的那些。嵌套PCR步骤-1扩增子的预期大小(作为扩增或复制事件的产物的DNA)是1,447bp,内部步骤2扩增子是941bp。在嵌套的PCR结果中没有1,447-BP和941-BP扩增子表明,WSSV DNA在较小的片段中降解并因此降低了感染性。相比之下,QPCR扩增子尺寸仅为69-BP,嵌套PCR的显着更小的扩增子。结果,即使当WSSV DNA在沸腾后脱落时,仍然可以扩增小型扩增子,并且通过QPCR获得阳性结果。

为了确认WSSV感染的感染性 L. Vannamei. 仅通过QPCR测试阳性,进行了使用SPF虾的实验挑战测试。所有罐中的最终存活率都高,QPCR WSSV阳性切碎组织从1至30分钟暴露于沸腾温度。仅在暴露于阳性对照组织(0分钟沸腾)的虾中获得了死亡率。在所有坦克的挑战结束时幸存的虾是通过h分析的&e和qpcr。在用阳性对照组织喂养的虾中发现了切口上皮和结缔组织中的WSSV包涵体。相比之下,在1,3,5,10和30分钟内用WSSV阳性组织挑战的虾的组织学没有显示出任何组织学病变的WSSV感染。图。图3A和3C显示了暴露于WSSV阳性组织的虾的组织学胃部1分钟。 QPCR分析由每个罐的两个池进行。在虾挑战WSSV阳性组织(阳性对照)中发现了唯一的QPCR阳性结果。

我们的研究结果表明,烹饪虾可以减少WSSV的扩散,从全球出口/进口路线进行养殖虾。我们认为,虾行业和其他人将利用我们对感染养殖虾的其他微生物病原体的检测方法感兴趣,包括其他病毒以及细菌和真菌。

透视

在我们的研究中,WSSV感染的虾在沸腾温度下煮熟不同的时间,包括0,1,3,5,10和30分钟。暴露于沸腾温度后,将WSSV感染的虾喂入SPF太平洋白虾(L. Vannamei.)。结果表明,从0分钟治疗(阳性对照)的实验挑战虾确实被WSSV感染了。然而,喂养1,3,5,10和30分钟的喂养组织的实验挑战虾未感染WSSV。

由此产生的死亡率数据显示,只有阳性对照(0分钟)治疗呈现出高死亡率,而在任何其他治疗中没有观察到凡人。这些研究结果表明,在沸腾温度下烹饪虾至少1分钟可能会阻止WSSV从流行国家的任何潜在的蔓延到尚未报道的WSSV的其他地理区域。应使用嵌套的WSSV检测方法,而不是QPCR方法,同时评估煮熟的虾的感染性。

相应作者可获得的参考资料。


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