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评估经双色球中奖概率感染的煮熟虾的传播风险

路易斯·费尔南多·阿朗格伦·卡罗,博士 麦红红博士 琳达·努南(Linda Nunan),理学硕士 林书豪(理学士) 布伦达·诺布尔,理学学士 Arun K.Dhar博士

结果显示,煮沸超过1分钟后虾肉无传染性

煮熟的虾
这项研究评估了被双色球中奖概率感染的太平洋白对虾的传播风险,结果表明,煮沸至少1分钟后,对虾没有传染性。 Darryl Jory摄影。

由白斑综合症病毒(双色球中奖概率)引起的白斑病(WSD)是对虾养殖业的最大威胁之一。 水务署会导致高死亡率,在成年后几天内,特定无病原体(SPF)人群中的死亡率可能高达100%。 双色球中奖概率最早是在1992年在台湾报道的。此后,在日本,韩国,东南亚,南亚,地中海,中东,美洲和澳大利亚都报道了双色球中奖概率的虾感染。

引入双色球中奖概率的风险主要归因于受感染虾的生产国和进口国之间的国际转移,无论是活的还是冷冻的(对虾(HO),对壳(HOSO)或对头无壳(HLSO))或作为煮熟的产品。由于存在通过商品意外引入虾病原体的风险,因此一些国家(包括澳大利亚,沙特阿拉伯王国等)已实施了严格的协议,规范了对虾和虾产品的进口。通过聚合酶链反应(PCR)进行筛选以确定某些病毒病因的存在与否。通常,如果批次为阳性,则将产品销毁或处理(煮熟)。

最近,经双色球中奖概率感染的熟虾通过聚合酶链反应(PCR)检测为阳性。但是,目前尚无确定通过PCR检测呈阳性的煮熟虾中双色球中奖概率感染性的研究。有发表的研究表明,冷冻虾产品是1995年双色球中奖概率进入美洲的一种途径,但是只有少数经过同行评审的出版物强调了煮熟的商品虾双色球中奖概率传染性的风险。然而,这些研究将他们的发现限制在通过PCR检测双色球中奖概率上,而含有DNA病毒序列的煮熟的虾是否具有传染性仍是未知的。在亚利桑那大学水产养殖病理学实验室的支持下,我们研究的目的是评估烹饪过程中被双色球中奖概率感染的虾的传染性。

研究设置

该研究中的虾来自美国的一家商业虾设施。总共250 SPF太平洋白虾(凡纳滨对虾),平均重量为10克。该样本重量代表在双色球中奖概率流行且即将爆发疾病的虾场进行紧急收获时池塘中虾的典型重量。

为了生产被双色球中奖概率感染的虾,通过将先前确认的被双色球中奖概率感染的切碎的虾组织喂入SPF,通过口服途径进行了双色球中奖概率攻击测试 南美白对虾 在一天中,以SPF动物的10%体重将其分为两个定量(早上和晚上)来完成。实验槽中的水保持在25 ppt的盐度和25摄氏度的温度下。经过实验性挑战后,每小时都会评估死亡率。 SPF 南美白对虾 被喂食健康组织并作为阴性对照。

一旦虾死亡率达到50%,将幸存的动物撤离以模拟紧急收获并实施安乐死。收集和腹足动物样品并保存,以通过常规和实时PCR分析进行确认。将五只具有临床体征的虾固定并保存用于组织学分析(图1)。

煮熟的虾
图1:研究的实验设计。

将最初感染的虾种群分为六组,每组40个虾。每组的具体沸腾时间(在淡水中)分别为0、1、3、5、10和30分钟。阴性对照是未感染双色球中奖概率的一组。每个40虾组分为两个亚组,每个亚组重复两次。在喂入SPF之前,使用不同的时间范围(0、1、3、5、10和30分钟)将第1组进行煮沸 南美白对虾。第2组也煮沸了不同的时间范围(0、1、3、5、10和30分钟),但在喂给SPF虾之前冷冻了(-20℃)14天(图2)。 。

煮熟的虾
图2:本研究中使用的实验设计的示意图,包括在沸水中在0、1、3、5、10和30分钟的不同时间处理双色球中奖概率感染的组织,然后进行直接实验或在SPF中进行实验性挑战之前将样品存储在冰箱中 南美白对虾.

使用置于尾部骨骼肌内部的温度计收集虾组织中的温度,并在烹饪过程之前和之后收集内部温度数据。煮沸后,使样品稍微冷却,然后收集g和腹足动物样品,并保存下来,以进一步分析PCR和qPCR(定量PCR是传统PCR的改进版本,用于检测和定量多种核酸应用程序)。

为了确定煮熟的虾的致病性,对SPF虾种群进行了攻击测试。每个90升的水箱中都装有10个少年(2至3克)。从每个时间范围的每个重复样本中,从所有虾中切碎包括胃,g和腹足类在内的虾组织并切碎。将切碎的组织以两种定量(早晨和傍晚)添加到储罐中,一天之内占活SPF种群总体重的10%。挑战的持续时间为11至12天。记录每日死亡率,并收集垂死虾的shrimp /足足动物池并保存,以用于通过qPCR和PCR进行双色球中奖概率检测。另外,垂死的虾被固定在戴维森固定剂中用于组织学分析。

在挑战结束时确定最终的累积存活率。每个池中收集所有虾的浮足动物样品,并保存在95%的乙醇中,以进行qPCR和PCR分析。每个鱼缸中的两只虾都固定在戴维森固定剂中,用于组织学分析。使用上述相同方法,将冷冻两周的虾(第2组)用于进行类似的双色球中奖概率感染挑战。

有关实验设计的详细信息;虾的实验性感染,采样和合并以及样品煮沸; 双色球中奖概率挑战测试; DNA提取; PCR和qPCR分析;和组织病理学,请联系相应的作者。

结果

双色球中奖概率感染的虾组织添加到实验池中,虾种群为10.5克±1克,造成很高的死亡率。第一组虾在感染后第2天开始死亡(d.p.i)。死后第4天,死亡率达到50%时,收集了幸存者。 PCR和H证实戴维森固定虾对双色球中奖概率呈阳性&E(苏木精和曙红染色或H &E染色是组织学中用于研究生物组织的微观解剖学的主要组织染色之一;见图1)。攻击过程中收集的三十只虾放在冰上,然后取样并通过qPCR和巢式PCR(PCR的改进设计,以提高特异性和敏感性)对双色球中奖概率呈阳性。

双色球中奖概率感染的虾暴露于不同的沸腾温度(0、1、3、5、10和30分钟)。煮沸过程结束时,取g和腹足动物样品进行PCR和qPCR分析。表1总结了未冷冻和冷冻两周的双色球中奖概率的qPCR和巢式PCR结果。蒸煮不同时间后收集的样品通过qPCR获得了双色球中奖概率的阳性结果。相反,没有样品通过巢式PCR提供任何扩增。

Aranguren,煮熟的虾,表1a

储罐说明(不冻结)qPCR 双色球中奖概率 –正号/正号总Ct值–平均值±SD嵌套PCR 双色球中奖概率 –正池号/号总
负控制0/4没有检测到 ND (0/1)
双色球中奖概率 30分钟烹饪4/421.48±3.05ND (0/1)
双色球中奖概率煮10分钟4/418.44±0.61ND (0/1)
双色球中奖概率 5分钟烹饪4/420.54±3.20ND (0/1)
双色球中奖概率 3分钟烹饪4/420.01±1.81ND (0/1)
双色球中奖概率 1分钟煮熟4/425.73±5.00ND (0/1)
双色球中奖概率 0分钟烹饪(正面控制)4/420.35±2.50正数(1/1)
表1a。使用从暴露于不同沸腾时间的虾样品中分离的DNA获得的qPCR和巢式PCR结果的摘要。

 

Aranguren,煮熟的虾,表1b

储罐说明(冷冻2周)qPCR 双色球中奖概率 –正号/正号总Ct值–平均值±SD嵌套PCR 双色球中奖概率 –正池号/号总
负控制0/4没有检测到 ND (0/1)
双色球中奖概率 30分钟烹饪4/421.10±2.29ND (0/1)
双色球中奖概率煮10分钟4/421.22±1.30ND (0/1)
双色球中奖概率 5分钟烹饪4/422.99±2.15ND (0/1)
双色球中奖概率 3分钟烹饪4/422.16±2.06ND (0/1)
双色球中奖概率 1分钟煮熟4/420.65±1.03ND (0/1)
双色球中奖概率 0分钟烹饪(正面控制)4/421.34±2.63正数(1/1)
表1b。使用从暴露于不同沸腾时间的虾样品中分离的DNA获得的qPCR和巢式PCR结果的摘要。

 

在治疗组1中,将被双色球中奖概率感染并暴露于不同煮沸时间的虾组织用作接种物中的接种物。 每个操作系统 使用SPF进行挑战测试 南美白对虾 虾。表2总结了10 d.p.i后虾的存活百分比。

煮熟的虾
表2.使用双色球中奖概率煮沸的组织作为接种物和SPF的实验性挑战测试结果的摘要 凡纳滨对虾.

在双色球中奖概率阳性对照(煮0分钟)水箱中仅发现高死亡率。 H&E和PCR证实了这些储罐中存在双色球中奖概率。将煮熟的虾冷冻两周,然后用作传染源,可获得相似的结果。

为H收集的样品&分析了实验结束时来自不同处理的E。在外胚层和中胚层起源的几个受影响的组织中发现了肥大核内的双色球中奖概率核内嗜碱性包涵体。图3显示了来自阳性对照罐的胃表皮上皮细胞中典型的双色球中奖概率组织学病变为4.0级。相反,在不同时间(1、3、5、10、30分钟)煮沸的虾组织中喂食虾组织的任何虾都没有表现出双色球中奖概率典型的任何组织学损害。

经qPCR检测双色球中奖概率呈阳性的实验感染煮虾的少年样品在所有情况下均为阴性(表3)。

煮熟的虾
图3:H&虾的E组织病理学 南美白对虾 煮沸后用双色球中奖概率感染的组织进行实验性感染。答:喂了双色球中奖概率阳性组织的虾煮沸1分钟。 B:虾喂入没有沸腾的双色球中奖概率阳性组织(0分钟,阳性对照); C:将双色球中奖概率阳性组织煮沸1分钟并冷冻2周的虾; D:虾喂入没有沸腾的双色球中奖概率阳性组织(0分钟)并冷冻2周(阳性对照)。

Aranguren,煮熟的虾,表3

油箱说明在不同时间煮熟并感染双色球中奖概率的虾qPCR 双色球中奖概率 –正号/正号总Ct值–平均值±SD
用SPF虾挑战SPF虾负控制0/4ND
用30分钟的双色球中奖概率感染虾对SPF虾进行挑战双色球中奖概率 30分钟煮虾的SPF挑战0/4ND
用双色球中奖概率感染的虾煮熟的SPF虾挑战10分钟双色球中奖概率煮10分钟0/4ND
用双色球中奖概率感染的虾煮5分钟,对SPF虾进行挑战双色球中奖概率 5分钟烹饪0/4ND
用双色球中奖概率感染的虾煮熟3分钟,攻击SPF虾双色球中奖概率 3分钟烹饪0/4ND
用双色球中奖概率感染的虾煮熟1分钟来攻击SPF虾双色球中奖概率 1分钟煮熟0/4ND
用双色球中奖概率感染的虾煮熟的SPF虾挑战0分钟 双色球中奖概率阳性对照(0分钟煮熟)4/421.57±1.73
表3.在暴露于不同沸腾时间的双色球中奖概率感染的虾中攻击的SPF虾的qPCR结果总结。

 

讨论区

我们的结果证明,暴露于沸腾温度达1至30分钟的双色球中奖概率感染的虾无传染性。 qPCR数据证实了所有暴露于不同沸腾时间的样品中均存在双色球中奖概率 DNA,并且未发现Ct(循环阈值,即可以在背景信号以上检测到PCR产物的荧光时的循环数)值的显着差异。在不同的沸腾时间之间(P<0.05)。但是,没有一个样品可以通过巢式PCR 双色球中奖概率成功扩增。

qPCR结果显示阳性结果,与嵌套式PCR阴性结果相反。从水煮虾中分离出的双色球中奖概率 DNA可能比从新收获的样品中分离出的双色球中奖概率 DNA受到了严重破坏,从而导致质量下降和碎片化。巢式PCR第1步扩增子(作为扩增或复制事件的产物的DNA片段)的预期大小为1,447 bp,内部第2步扩增子为941 bp。巢式PCR结果中不存在1,447-bp和941-bp的扩增子,这表明双色球中奖概率 DNA在较小的片段中已被降解,因此丧失了传染性。相反,qPCR扩增子的大小仅为69 bp,比巢式PCR的扩增子小得多。结果,即使双色球中奖概率 DNA在煮沸时断裂,仍然可以扩增小的扩增子,并通过qPCR获得阳性结果。

为了确认感染了双色球中奖概率的传染性 南美白对虾 仅通过qPCR检测为阳性的人,使用SPF虾进行了实验性攻击测试。在所有qPCR 双色球中奖概率阳性切碎的组织中,所有暴露于沸腾温度1至30分钟的罐中,最终存活率都很高。仅在暴露于阳性对照切碎的组织(煮沸0分钟)的虾中获得死亡率。 H对所有坦克挑战结束后存活的虾进行了分析&E和qPCR。在用阳性对照切碎的组织喂养的虾中发现了表皮上皮和结缔组织中的双色球中奖概率包涵体。相比之下,在1、3、5、10和30分钟煮沸的双色球中奖概率阳性组织攻击的虾的组织学未显示出双色球中奖概率感染的任何组织学病变。图3A和3C示出了暴露于煮沸1分钟的双色球中奖概率阳性组织的虾的组织学胃部。从每个槽的两个池中进行qPCR分析。在用双色球中奖概率阳性组织攻击的虾(阳性对照)中发现唯一的qPCR阳性结果。

我们的研究结果表明,煮虾可以减少全球虾养殖出口/进口途径中双色球中奖概率的传播。我们认为,利用我们的方法来检测感染养殖虾的其他微生物病原体,包括其他病毒以及细菌和真菌,将对虾业和其他行业产生兴趣。

观点

在我们的研究中,感染双色球中奖概率的虾在沸腾温度下煮了不同的时间,包括0、1、3、5、10和30分钟。暴露于沸腾温度后,将感染双色球中奖概率的虾喂入SPF太平洋白虾(南美白对虾)。结果表明,经过0分钟处理(阳性对照)的经过实验挑战的虾确实感染了双色球中奖概率。但是,喂食煮沸了1、3、5、10和30分钟的组织的经过实验挑战的虾并未感染双色球中奖概率。

所得的死亡率数据表明,仅阳性对照(0分钟)治疗显示出高死亡率,而在其他任何治疗中均未观察到死亡。这些发现表明,在沸腾温度下煮虾至少1分钟可能会阻止双色球中奖概率从流行国家传播到尚未报告双色球中奖概率的其他地理区域。在评估煮熟的虾的传染性时,应使用嵌套式双色球中奖概率检测方法代替qPCR方法。

参考可以从相应的作者处获得。


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