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开发用于检测和定量NHPB的新型实时PCR

路易斯·费尔南多·阿兰古伦博士 Arun K.Dhar博士

所描述的新方法是用于确认坏死性肝胰腺炎的细菌病原体的另一种诊断工具

 国家卫生局
太平洋白虾显示NHPB的临床体征;少年(左);成人(右)。

坏死性肝胰腺炎(NHP)是由革兰氏阴性细菌引起的肠细菌性疾病,分类为 戊型肝炎 (NHPB)。它影响美洲几个国家(包括美国,墨西哥,伯利兹,萨尔瓦多,危地马拉,洪都拉斯,哥斯达黎加,尼加拉瓜,巴拿马,巴西,哥伦比亚,厄瓜多尔,秘鲁和委内瑞拉)种植的对虾。

NHP是一种慢性疾病,可导致太平洋白虾的幼体(PL),幼鱼和产卵的死亡率高达50%到95%(南美白对虾)受影响。农场一级NHP的临床体征表现取决于高盐度和高温等环境条件。感染NHP的虾显示出典型的软壳,松弛的身体,减少的采食量和空的消化道。

NHP感染的过程分为两个阶段:急性和慢性阶段。受NHP感染的虾的急性期病变包括坏死和黑色素化肝胰腺(HP)和HP小管中上皮细胞的脱落。在慢性期,HP病变的特征是肾小管萎缩,上皮细胞高度降低,R细胞中脂质存储量低和肾小管内水肿。

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图1:H部分&受到NHP影响的虾肝胰腺中的E显示坏死,表皮上皮细胞脱落(由小箭头指示)和黑色素化的小管(由大箭头指示)。 H&E 200X.

自1988年首次报告以来,NHP已成为西半球虾养殖业的主要疾病,并于2010年被列入《世界甲壳动物疾病卫生组织( OIE)。已经开发出了几种诊断方法来检测和确认NHPB的存在,包括聚合酶链反应(PCR),组织学和原位杂交以及qPCR。但是,OIE手册中仅推荐一种PCR方法,这就需要用于检测和确认NHPB的替代PCR和实时PCR(qPCR)分析方法。

OIE手册中推荐的唯一方法是基于亚利桑那大学水产养殖病理实验室(UAZ-APL)开发的基于16S rRNA基因扩增的当前PCR和qPCR分析方法。尽管这些技术对虾中NHPB的检测非常灵敏且具有特异性,但近年来,当在发送到UAZ-APL的盐水虾囊中分析NHPB样本时,在端点PCR中偶尔会观察到非特异性扩增。 。

提高NHPB检测的特异性

为了提高通过PCR和实时PCR检测NHPB的特异性,我们针对了NHPB鞭毛基因的一个区域,称为鞭毛钩蛋白( g ),仅存在于鞭毛细菌中。鞭毛基因已在不同细菌组中以谱系特异性方式进化和分化,这使得该基因区域对于NHPB的检测具有高度特异性。

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图2:包括flgE区域的细菌鞭毛系统示意图(改编自Liu等,2017)。

使用来自卤虫囊肿的两个样品(图3左图的18-316和17-689)中的16S rRNA引物进行PCR扩增子的琼脂糖凝胶电泳,显示出一些非特异性条带,长度为379 bp (图3)。右侧面板显示用引物扩增的同一组样品 g 。  与使用16S rRNA引物进行扩增不同,使用引物进行扩增 g  在电泳凝胶上未显示扩增产物。从16Sr rRN引物的扩增子测序证实了非特异性扩增产物。

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图3:使用基于两种不同基因16S rRNA和flgE基因的引物,PCR检测盐水虾囊肿样品中的NHPB。

我们还开发了一种针对相同目标的新实时PCR方法 g  区域并使用TaqMan水解探针(旨在提高定量PCR的特异性)。新的NHPB实时PCR检测没有提供任何与当前OIE实时PCR检测相同的非特异性扩增,检测极限为100个拷贝,对数线性范围最大为108 副本。

灵敏度

使用来自七个来源的10个NHPB阳性样品并使用两组不同的引物分别测定了新NHP 聚合酶链反应 的分析灵敏度:16S rRNA和 E级 。在图4中,琼脂糖凝胶的左侧显示了使用当前OIE推荐的方法(16S rRNA)扩增的样品。右边是用新方法扩增的相同样品。两种方法均在琼脂糖凝胶上提供了相似的结果和相似的DNA条带强度。

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图4:基于常规PCR,在基于16S rRNA和flg E的十个不同感染南美白对虾肝胰腺样品中,通过常规PCR检测NHPB。M基因:分子量标记阶梯1 kb或更高; ntc,无模板控件; 1,厄瓜多尔2015a; 4,墨西哥,2013年; 5,德克萨斯州2013a; 6,伯利兹2016; 7,巴拿马2016; 8,德克萨斯州2006a; 2016年洪都拉斯9日; 10,德克萨斯州2006b; 11,德克萨斯州2013b; 12;巴西2012年。

为了确定使用基于基因的方案进行扩增的特异性 g ,从感染病毒性疾病(包括IMN,YHD,IHHN,WSD和TS)的虾中提取的DNA,以及细菌性疾病,包括 V. parahaemolyticus,V. harveyi,螺旋藻-V. parahaemolyticus 将AHPND和NHPB的病因用作PCR扩增的模板。除NHPB外,所有虾类疾病均获得阴性结果。这表明用于基因扩增的引物的高特异性。 g  在检测NHPB中。

我们还调查了从不同地理区域获得的NHPB分离株的系统发育关系。这项研究中使用的NHPB阳性样品来自美国德克萨斯州(2016年的样品a和b),厄瓜多尔(2011年),墨西哥(2013年),美国德克萨斯州的样品(样品a,b&2013年c),厄瓜多尔(样本a&b自2015年以来)和洪都拉斯(2016年)。基于16S rRNA基因的系统发育分析显示了两组:一组包含来自厄瓜多尔的分离株,而第二组包含来自墨西哥和美国德克萨斯州的分离株(图5)。 2011年和2015年来自厄瓜多尔的样本被归为同一组,表明存在相同的NHPB分离物。

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图5:12个戊型嗜血杆菌地理分离株(NHPB)的16S rRNA序列比对的系统发生树。

国家卫生局 在农场一级的含义

据报告,在农场的亚成年和亲虾种群中存在NHP,导致美洲地区的死亡率有所不同。在某些国家(例如哥伦比亚),NHP不会像其他国家那样导致严重的死亡,并且并非总是能够检测到NHP的典型临床体征。这种现象可能与某些线的电阻有关 南美白对虾 到NHP。 国家卫生局 分离株的致病性也可能不同,这可能解释了不同地区的不同死亡率模式。

观点

我们描述了基于基因的实时PCR和常规PCR分析 g   国家卫生局 作为检测和定量对虾以及与对虾(包括盐水虾)有关的虾样品中NHPB的替代方法。

两种测试都是高度特异性和敏感性的。 NHP 聚合酶链反应 的灵敏度 g  它与当前推荐的OIE方法相似,但是由于与当前的OIE方法相比具有更高的特异性,因此上述方法将成为确认该病原体的另一种诊断工具。

第一作者提供参考。