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一次性电极的电化学WSSV检测

武村健新博士 佐藤准博士 Jirayu Boonyakida博士 成城公园博士 安坎·杜塔·乔杜里博士 Enoch Y.Park博士

首次成功演示了一种识别重要虾病原体白斑综合症病毒的新方法

一次性电极
这是首次成功地使用新型一次性电极对白斑综合症病毒(养殖虾中最重要的病原体之一)进行电化学检测,对全球造成数十亿美元的损失。费尔南多·韦尔塔摄。

白斑综合症病毒(WSSV)感染虾并导致白斑病(WSD),白斑病被认为是全球养殖虾业中最致命,成本最高的致病病毒之一。疫苗接种始终是解决任何病毒感染的最有用方法,并且已经报道了一些尝试诱导免疫反应和保护虾免受WSSV感染的尝试,但是考虑到它们的疫苗接种效果仍然很差实际使用。为了避免在虾类养殖中发生WSD的风险,重要的是要有一种方法来快速识别任何受感染的虾。

当前检测WSSV的方法是基于聚合酶链反应技术(PCR,一种广泛使用的方法,该方法可使用病毒DNA技术或检测方法快速生成数百万至数十亿个特定DNA样品的拷贝)。使用特定抗体的蛋白质的检测限,LOD(数百种拷贝的LOD(一种物质的最低含量,可以与通常不存在该浓度的99%置信水平区分开)在4至12个小时内每毫升DNA含量的变化。用于水产养殖的诊断性PCR检测方法受成本和训练有素的操作员的限制。其他WSSV检测方法包括其他复杂的技术,例如斑点印迹,侧向流动测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)。

具有物理特性的纳米材料[具有至少一个尺寸的单一尺寸单位(至少一个尺寸)在1到100纳米之间的材料(公制中的长度单位等于十亿分之一米或0.000000001米),独特的光学和电化学技术已成功用于各种病毒的高灵敏度检测。电化学阻抗谱(EIS)是一种用于分析各种分子反应的性质和识别的灵敏技术,生物传感器可以直接检测各种分子事件。例如,我们已经证明了基于工程阻抗法,使用由特定抗体和纳米材料制成的生物传感器电极对戊型肝炎病毒进行检测。

本文改编自 原版的 [Takemura,K。等。 2020年。使用由石墨烯量子点和金纳米粒子嵌入的聚苯胺纳米线组成的硅橡胶一次性电极对白斑综合症病毒进行电化学检测。 纳米生物技术 18,152(2020)]报道了一种可精确检测WSSV的一次性电极,该电极可能在水产养殖业中具有重要的应用。

工作室设置

有关用于制造测试电极的高科技工艺,设备和材料的详细信息,包括传感器电极上的纳米复合材料沉积以及WSSV的收集和预处理,以及使用WSSV进行的检测。一次性电极,请参阅原始文章。

结果与讨论

我们开发的一次性电极在其测试过程中证明了能够在宽线性范围内以高特异性和灵敏度检测WSSV的能力。还对传感器的稳定性进行了一个多月的测试,以确认其在原位病毒检测中的适用性。

孵育不同浓度的10种病毒后的一次性电极的电阻抗图(施加电压时电路对电流的抵抗程度的度量)2 a 109 每毫升拷贝数如图1a所示。感官电极响应随WSSV浓度的增加而增加,这是因为在病毒载带的电极上积累了高电阻。当WSSV结合到传感电极上时,大量的非导电病毒颗粒会覆盖导电表面,从而增加电阻。

校准图显示了电阻与WSSV浓度之间的极好的线性关系(图1b)。检出限LOD被确定为低至每毫升48.4拷贝,在实际使用中极低且灵敏。在检测到WSSV后,载有病毒的电极表面显示出明显更高的粗糙度,表明电极上存在WSSV。

一次性电极
图1:使用一次性电极的WSSV检测。 (a)不同浓度WSSV的阻力图。轴值以欧姆为单位,用于测量电阻。 (b)相应的阻抗校准曲线。负载电阻值(Rct)是腐蚀电化学和电化学反应的一项重要指标。每次检测进行了3次,数据以平均值±SD(n = 3)给出。

我们将检测性能与其他几种WSSV检测方法进行了比较。许多研究已成功检测出DNA,但是由于需要从WSSV中提取DNA,因此难以快速进行原位检测。我们的检测系统实用,因为它具有很高的灵敏度,简便性和适用于现场检测的适应性。

关于一次性电极的选择性和稳定性,并确认对WSSV的特异性,我们在使用感应电极的研究过程中还测试了其他几种病毒和某些材料。传感器响应(除了WSSV,图2a)类似于裸电极,表明传感器对靶病毒的特异性。传感器的高选择性是通过使用各种材料进行特殊涂层并进行有效清洁来实现的。当存在许多异物并且传感器表面发生非特异性吸附时,目标WSSV以外的其他物质将通过高效清洗液去除,从而实现了我们检测方法的高选择性。

测试了一次性电极的稳定性八周,以了解其在长期使用中的适用性。如图2b所示,充电后的信号强度为104 到第35天,每毫升病毒的拷贝数仍保持在86%。但是,由于所用抗体的降解,在储存56天后,它降至73.4%。

一次性电极
图2:(a)与非目标病毒以及各种离子和其他物质相比,用于检测WSSV的电极涂层的选择性测试。 (b)一次性电极的稳定性测试。电极在冰箱中存放56天,从第二周开始每周检测一次检测性能。从原来改编。

在缓冲液中成功检测到WSSV后,从10只WSSV感染的虾中收集病毒样品并进行分析。将它们的DNA拷贝数与通过这种电化学检测技术获得的结果进行比较。样品PCR结果的总体趋势与电化学传感器结果的趋势显示出出色的相似性,从而证实了传感器结果的可重复性。总体而言,我们的数据表明,我们的检测系统比目前用于WSSV的其他检测技术(例如蛋白质印迹)具有更高的灵敏度,六到七个数量级,并且可以在更短的时间内从受感染的动物中检测出WSSV。 20分钟。

观点

我们开发并验证了一种一次性电极,可在20分钟内快速灵敏地检测出白斑综合症病毒(WSSV)。在测试过程中,我们的传感器检测到病毒的线性范围很广,为102 a 109 每毫升DNA拷贝数,检测极限为每毫升48.4个拷贝。一次性电极的功能已成功显示出约五周的高选择性和长期稳定性。

该检测能力还已经成功测试了其他病毒,这表明它具有广泛的应用前景。该传感器被用于从感染了WSSV的养殖虾中检测病毒,并被发现与当前使用的PCR检测方法具有可比性,从而证实了其作为实时病毒检测的出色监控系统的适用性。

这是具有高灵敏度,选择性和稳定性的纳米传感器电极对WSSV检测的首次展示,表明其在水产养殖行业中作为监测WSSV的诊断工具的潜力。该检测系统在控制WSSV的传播方面可发挥重要作用,而WSSV的扩散可用于虾生产设施中的现场检测系统。


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