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El microsporidio 佩雷西亚 sp。 y la 虾棉病

韩德恩(Dee Eun Han),博士 李承chan 首尔陈公园 马克·格罗米勒克,DVM博士

通过组织病理学以及新的原位杂交和PCR方法进行检测

la 虾棉病
在这项研究中,感染小孢子虫病的虾样品包括黑虎虾(斑节对虾),采集于马达加斯加,莫桑比克和沙特阿拉伯王国,并有棉花虾病的临床症状。 Darryl Jory摄影。

从无脊椎动物到人类,微孢子虫是专一的细胞内寄生虫。微孢子虫的研究更多地集中在陆地宿主上,但是已知的微孢子虫属的约50%感染了甲壳类和鱼类等水生宿主。这些水生宿主的微孢子虫感染被认为是潜在的健康危害以及水产养殖的财务风险。

影响虾类养殖的重要疾病之一是“虾棉病”(CSD),并且与这种疾病相关的病原体是至少五个属中发现的小孢子虫,包括 凤尾蕨,Thelohania,Perezia,Agmasoma y 阿梅森 。这些微孢子虫寄生虫主要感染骨骼肌,使受影响的身体区域呈白色或不透明,这使该疾病成为俗称。轻度感染的虾可能看起来和行为正常,但严重的感染使虾无法销售或无法食用。在虾中,肌肉暗淡的白色外观主要与微孢子虫感染有关。但是,其他致病因素,例如鞭毛鞭毛藻,细菌或病毒也可能与此疾病有关。

这项研究的重点是从马达加斯加,莫桑比克和沙特阿拉伯王国收集的虾中与CSD相关的微孢子虫。我们调查了其组织病理学特征,并通过对rDNA的小亚基(rDNA的SSU)进行测序来确定其分类学分类。这些序列被广泛用于阐明生物之间的进化关系,因为它们起源很久,并且存在于所有已知的生命形式中。

此外,基于以下方面开发了针对该疾病的特定诊断方法:1.原位杂交[ISH;使用DNA,RNA或修饰的核酸(即探针)的互补标记链在组织的一部分或部分中定位特定DNA或RNA序列的杂交类型]; 2.聚合酶链反应(PCR),一种在分子生物学中广泛使用的方法,用于靶向rDNA SSU序列的许多拷贝。

研究设置

在过去的几年中,从马达加斯加,莫桑比克和沙特阿拉伯从亚利桑那大学水产养殖病理学实验室运送了总共298份具有CSD临床症状的虾样品。表1汇总了相关信息。

Han,CSD,表1

国家和物种体育场 格拉多 目标器官阳性/总样本数 聚合酶链反应
马达加斯加(斑节对虾) 成人 G3-G4肌肉3/3 不适用
马达加斯加(斑节对虾)青年G3-G4肌肉/马力6/30 不适用
马达加斯加(斑节对虾)亚成人 不适用 肌肉/马力 不适用 位置
马达加斯加(斑节对虾)亚成人G3-G4肌肉/马力4/19 不适用
马达加斯加(斑节对虾) 大人 G2-G3肌肉/ HP /心脏3/5 不适用
马达加斯加(斑节对虾)亚成人G1-G3肌肉/马力6/28 不适用
马达加斯加(斑节对虾)青年 不适用 肌肉 不适用 位置
马达加斯加(斑节对虾)青年G3-G4肌肉/马力35/35 不适用
马达加斯加(斑节对虾)青年 不适用 肌肉/马力 不适用 位置
莫桑比克(斑节对虾)青年G3-G4G3-G4肌肉/胆/
心/ LO
4/23 不适用
莫桑比克(斑节对虾) PL G3-G4G3-G4肌肉/胆/
心/ LO
2/50 不适用
莫桑比克(斑节对虾) 大人 G3-G4G3-G4肌肉/胆/
心/ LO
4/4 不适用
沙特阿拉伯(P. indicus) 大人 G4G3-G4肌肉/胆/
心/ LO
3/3 不适用
沙特阿拉伯(P. indicus) 大人 G2-G4肌肉/马力30/93 不适用
沙特阿拉伯(P. indicus) 大人 不适用 肌肉 不适用 位置
沙特阿拉伯(P. indicus)青年G2-G4肌肉/马力5/5 不适用
表1.本研究中使用的虾棉病样品(从原始表中修改)。通过组织病理学检查(存在小孢子虫病)和PCR测定法分析样品。 G级系统的范围从G0(负)到G4(最高重力)。 聚合酶链反应 栏显示Perezia sp。的阳性靶器官。 (HP:肝胰腺; LO:淋巴器官)。 PL :幼虫; pos:正;不适用:不可用。

结果与讨论

组织病理学检查

在虾和其他甲壳类动物中, 佩雷西亚 spp。破坏肌肉并逐渐被大量寄生虫和孢子发育阶段取代肌肉组织。在感染的后期,寄生虫会侵入同一只虾中的其他组织和器官,例如触角腺的心肌细胞,上皮细胞和结缔组织细胞。在这项研究中,来自同一只虾的几种组织受到这种微孢子虫的影响。组织病理学检查发现从马达加斯加,莫桑比克和沙特阿拉伯收集的样品中有大量微孢子虫孢子。感染主要影响肝胰腺和肌肉,严重程度对应于从G1到G4的程度。

在骨骼肌纤维(图1A,B)和孢子前阶段之间观察到了成熟的孢子,并且感染了肝胰腺小管的上皮细胞产生了芽孢(图1C,D)。在严重感染中,在分支细丝的上皮细胞(图1E,F),心肌纤维(图1G)和淋巴器官的实质细胞(图1H)内也观察到孢子。在感染的晚期阶段散布到全身的孢子可能来自肌肉感染:肌肉逐渐变质,并且孢子污染了周围的组织。此外,大多数CSD病例(90%)伴有由by引起的g污疾病感染 sp。 Ø 上sty sp。,这表明患有小孢子虫病的动物可能较弱,易受继发感染或侵扰。

la 虾棉病
图1:在马达加斯加,莫桑比克和沙特阿拉伯的皮虾中发现的由微孢子虫引起的典型病害特征。 (A,B)骨骼肌纤维之间积累的成熟孢子; (C,D)肝胰腺小管的上皮细胞内的孢子(箭头)和孢子阶段(箭头)(插图显示可分离的细胞); (E,F)在分支丝的上皮细胞内成熟孢子的胞质内积累; (G)心脏肌肉纤维内的成熟孢子; (H)淋巴器官的肾小管实质细胞。 Mayer-Bennett染色:(A,C,E,G,H)苏木/曙红-phloxin; (B,D,F)吉姆萨。比例尺= 30 µm。

引起CSD的新微孢子虫的rDNA的SSU序列

我们从马达加斯加收获的具有CSD的虾中进行了靶向rDNA SSU序列的PCR,并获得了1.2 kbp的片段并进行了测序。 rDNA的SSU核苷酸序列已保存在Genbank中。根据测试结果,该核苷酸序列与rDNA SSU序列具有94%的同一性。 凤尾蕨 sp。感染 对虾,与未鉴定的微孢子虫具有93%的同一性 木对虾。在2002年, 凤尾蕨 sp。 德 set 被重新标识为 百日草 通过形态学检查。因此,基于序列信息,我们现在认为新鉴定出的微孢子虫属于该属 佩雷西亚,我们将其称为 佩雷西亚 sp。此后。 可持续发展委员会 引起的 佩雷西亚sp。它似乎已扩展到若干对虾生产国,包括马达加斯加,莫桑比克,沙特阿拉伯(本研究),美国和日本,但对它的研究还不够。

在这项研究中,从马达加斯加和沙特阿拉伯的样品中提取的基因组DNA进行了针对rDNA SSU的特异性引物的PCR。对于两个样品,获得的序列是100%相同的。巧合的是,在这三个国家(马达加斯加,莫桑比克和沙特阿拉伯)检测到的白斑综合症病毒(WSSV)也显示出相同的基因组模式。

佩雷西亚 sp。 -特定的ISH

探针对骨骼肌和肝胰脏(图2A-C)以及其他器官(如腮,心脏和淋巴器官)都强烈反应(数据未显示),与组织病理学结果相对应。由rDNA SSU序列设计的探针。 佩雷西亚 sp。似乎特指马达加斯加,莫桑比克和沙特阿拉伯具有CSD症状的虾。

首先,我们误认为了 佩雷西亚 sp。通过正常的组织病理学检查可知是否感染了EHP。但是,此ISH探针对 细角对虾 感染 肝大肠埃希菌 (图2D)。在由以下方法制备的任何组织中均未观察到反应 南美白对虾 不含病原体。都没有 南美白对虾 y 斑节对虾,以及感染了类似于 Agmasoma 身份不明,对ISH探针没有反应(此处未包含数据)。

la 虾棉病
图2:使用地高辛标记的特定基因探针进行的原位杂交(ISH)分析,用于检测引起虾棉病的微孢子虫。暗蓝色沉淀表明在肝胰腺小管的上皮细胞中存在寄生虫(A) 印度对虾 (B)来自沙特阿拉伯的骨骼肌纤维 斑节对虾 莫桑比克和(C)的肝胰腺小管的上皮细胞内 斑节对虾 来自马达加斯加。 (D)被Enterocytozoon hepatopenaeique感染的文莱P. stylirostris肝胰腺的一部分显示出代表性的结果,强调了探针的特异性,这是由缺乏深蓝色沉淀物所证明的。染色:Bismark-Brown复染。比例尺= 30μm。

佩雷西亚 sp。 -特异性PCR

为了诊断目的,我们设计了一对靶向DNA的PCR引物 佩雷西亚 sp。我们生成了一个443 bp的扩增子(分子生物学术语,指的是扩增或复制事件的来源和/或产物的DNA或RNA片段),如图3所示。特定于微孢子虫 佩雷西亚 sp。这会导致CSD,因此可用于监视此寄生虫。这些引物不与感染了虾的虾的微孢子虫DNA反应。 肝大肠埃希菌 (数据未显示)。此外,没有与虾基因组DNA发生交叉反应(南美白对虾,斑节对虾,印度对虾,细角对虾 y 罗氏沼虾),多毛et,鱿鱼和 卤虫 spp。 (数据未显示)。

我们没有通过PCR分析莫桑比克样品,但是该探针对ISH反应强烈,从而使反应产物沉积在莫桑比克样品的靶细胞上。在这项研究中,我们描述了微孢子虫,它感染了马达加斯加,莫桑比克和沙特阿拉伯红海-印度洋地区虾的肌肉和引起CSD的肝胰腺。

la 虾棉病
图3:PCR的特异性结果 佩雷西亚 sp。泳道1-2:的肝胰腺 斑节对虾 来自马达加斯加;泳道3-6:肌肉 斑节对虾 来自马达加斯加;泳道7-8:肌肉 印度对虾 来自沙特阿拉伯;泳道9:肝小肠肠杆菌(EHP);泳道10:无特定病原体(SPF)对照;泳道11:阴性对照(NC)。

观点

通过组织病理学分析证实微孢子虫感染,并鉴定出寄生虫为 佩雷西亚 sp。此外,我们开发了能够检测该寄生虫的ISH和PCR分析方法。这些方法可以帮助虾农对微孢子虫引起的CSD进行诊断和管理。 佩雷西亚  sp。

第一作者提供参考。


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