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WSSV和副溶血性弧菌共感染研究

韩德恩(Dee Eun Han),博士,博士 金智恩女士 MS Hayay Jo 尹钟秀博士 李卓荣博士 金智亨博士 李景俊博士 金在元博士

结果显示太平洋白虾中AHPND的危险因素

共同感染
这项研究的结果表明,最初暴露于WSSV的虾比单独感染VpAHPND的虾能使VpAHPND造成更快和更高的死亡率。费尔南多·韦尔塔摄。

由细菌的特定菌株引起的急性肝胰腺坏死病(AHPND) 副溶血性弧菌 (副总裁 AHPND自2009年以来,已有报道在东南亚和美国养殖的虾中出现。该病的临床体征包括萎缩性肝胰脏(HP),胃肠道空洞,胃部乳白色和嗜睡。这种细菌性疾病导致太平洋白虾种群的死亡率高达100%(南美白对虾)和黑虎虾(斑节对虾),全球因AHPND和其他虾类疾病造成的集体经济损失估计为236亿美元,另外70亿美元的食品销售损失。

在某些情况下,VpAHPND 与形成孢子的微孢子虫共感染 肝小肠肠杆菌 (EHP)。尽管EHP似乎没有引起死亡,但受EHP感染的动物更易受到AHPND的影响,这可能导致虾塘大量死亡。而且被EHP感染的虾对Vp的敏感性更高AHPND,表明EHP弱化的虾会屈服于Vp等次生病原体AHPND.

多年来,白斑综合症病毒(WSSV)已在亚洲,美洲,欧洲,非洲,中东和澳大利亚的许多地区传播到世界各地。在某些情况下,已在健康动物中检测到WSSV,而没有临床症状或死亡,这表明WSSV感染并不一定导致高死亡率,以及机会性病原体(例如, 弧菌 spp。,会加速疾病的发作。

2017年的死亡率为 南美白对虾 在菲律宾高达60%。该虾表现出AHPND的临床体征,但PCR证实它们的两个Vp均为阳性AHPND 至于WSSV。从这种情况下,我们假设没有临床症状的WSSV感染将允许VpAHPND 会比单独感染Vp的池塘养殖虾造成更快和更高的死亡率AHPND.

本文根据原始内容进行了改编和总结,报告了一项旨在通过模拟与WSSV和Vp的共感染来支持该假设的研究。AHPND 卡马龙 南美白对虾 在实验室条件下的少年。结果,我们表明最初暴露于WSSV的虾很容易被Vp感染AHPND,但根据组织病理学检查几乎没有从疾病中康复。此外,使用qPCR分析和免疫组织化学[IHC;免疫染色的最常见应用涉及在组织切片中使用抗体与抗原的特异性结合来选择性鉴定组织切片中细胞上的抗原(蛋白质)的过程,我们确定WSSV感染可能是继发性Vp感染加速AHPND .

这项工作得到了韩国政府资助的国家研究基金会(NRF)赠款(MSIT)的支持(批准号NRF-2018R1C1B5086350)。

研究设置

后幼虫 南美白对虾 它们是从当地的虾场(韩国济州)获得的,并被运往韩国济州国立大学海洋科学研究所。将虾放在96升的储罐中,使其平均重量为0.5±0.05克,并在25至28摄氏度和30 ppt的盐度下充气人工海水。对于共感染实验,从储水箱中随机选择幼虾(平均0.5克,N = 80)并分配到实验水箱中。在共感染实验之前,随机选择代表性虾并通过PCR确认它们对WSSV和Vp均为阴性AHPND.

对于WSSV人群, 南美白对虾 死于位于韩国西海岸忠清道的一个匿名虾场,其表皮上有白色斑点。对于Vp细菌AHPND,以前从胃的胃中分离出13-028 / A3菌株 南美白对虾 在越南的一个农场死于发白的肝胰腺(HP)。

有关WSSV和VpAHPND共感染的实验设计的详细信息; qPCR分析; IHC检查g组织; HP组织的组织病理学检查;和统计分析,请参见原始出版物。

结果与讨论

我们研究了虾中WSSV和VpAHPND的共同感染 南美白对虾 实验室条件下的青少年,以及死亡率与单个感染组进行比较。

我们的结果表明,与单一感染相比,共同感染可提高虾的死亡率(图1)。我们观察到第1组的死亡率为0%(仅WSSV),而第2组的感染(p.i.)第4天的累积死亡率为50%(仅Vp)AHPND)。但是,第3组的死亡率显着增加(WSSV + VpAHPND)与其他组(p<.05)。在第3组中,虾在下午2天开始表现出死亡率,而累积死亡率在下午3天达到75%。在10天的实验期内,阴性对照(第4组,无疑问)中未观察到死亡率。

共同感染
图1:用WSSV和VpAHPND攻击后南美白对虾的累积死亡率(第1组:仅WSSV;第2组:仅VpAHPND;第3组:WSSV + VpAHPND;第4组:未攻击)。与单一感染组(第1组和第2组)相比,合并感染组(第3组)的死亡率显着增加。不同的字母表示到完成日期(第10天)的生存率存在显着差异(P<.05).

我们的研究结果还表明,通过qPCR和IHC证实,共感染增加了WSSV感染水平,并且第1组(仅WSSV)和第3组(WSSV +副总裁AHPND)在完成日期(第10天)。根据qPCR分析,在第3组的虾中发现了WSSV(WSSV + VpAHPND),但仅暴露于WSSV的虾中WSSV为阴性(第1组)。此外,通过IHC检查,在粉红色的细胞质和紫色核上出现了棕色染色,表明在第3组虾(WSSV + Vp)中发现了WSSV的阳性反应AHPND)(图2D)类似于先前在初步研究中制备的WSSV阳性样品(图2B)。然而,在单独暴露于WSSV的虾(第1组;图2A)和阴性对照(未挑战的第4组;图2C)中,未观察到对WSSV的阳性反应。

合并感染降低了Vp感染的恢复AHPND。在第2组感染的三到四天内,所有实验性虾均表现出AHPND的典型临床症状,包括苍白的HP和空肠,仅Vp AHPND)和第3组(WSSV + VpAHPND),并感染VpAHPND 通过qPCR和组织病理学检查证实。通过qPCR分析,检测到VpAHPND 从第2组(仅Vp)收获的死虾中AHPND)和第3组(WSSV + VpAHPND)en losdías3年4。

通过组织病理学检查,来自第2组的代表虾(仅VpAHPND)和第3组(WSSV + VpAHPND)显示出典型的终末期,其特征是在第3天出现大量细菌感染并在G3-4水平(4级最严重)从肝胰管上皮细胞脱落。

共同感染
图2:对感染了白斑综合症病毒(WSSV)的虾进行免疫组织化学(IHC)检查。 (A)阴性对照(第4组):在of的no中没有被WSSV感染的细胞 南美白对虾。 (B)阳性对照:通过饲养方法感染了WSSV组织的南美白对虾。中的WSSV阳性细胞。 (C)WSSV对照(第1组):of的no中没有WSSV感染的细胞 南美白对虾 通过浸没方法感染了WSSV。 (D)WSSV和VpAHPND感染(第3组):of的WSSV阳性细胞 南美白对虾 预先感染了WSSV,随后又感染了次级病原体VpAHPND。苏木复染色。比例尺:40μm。

然而,在终止日(第10天),第2组之间仅对存活虾的HP组织病理学观察到显着差异(仅VpAHPND)和第3组(WSSV + VpAHPND)。第2组幸存者的组织病理学迹象(仅VpAHPND)具有正常外观和B细胞和R细胞功能的HP(图3B),与阴性对照(第4组,图3A)相同。相比之下,第3组幸存者(WSSV + VpAHPND)在HP中显示AHPND组织病理学的典型体征,伴有大量细菌感染和严重程度为G4的肝胰管上皮细胞脱落(图3C)。

共同感染
图3:在终止日(第10天),使用来自感染了VpAHPND的虾的Davidson AFA固定组织切片进行的组织病理学检查。 (A)阴性对照(第4组):肝胰腺的正常外观。 (B)AHPND对照(第2组):肝胰脏外观正常且B和R细胞功能正常。(C)WSSV和VpAHPND合并感染(第3组):典型的急性期,伴有进行性坏死和大量脱离肝胰管的上皮细胞。苏木/曙红-phloxin(H&E)来自Mayer-Bennett。比例尺:180μm。

在实际的虾类养殖中,多种病原体的感染(共同感染)很常见。在不同国家的不同皮氏物种中,已有几例被WSSV感染的虾弧菌病报道。尚无关于这些病原体在与WSSV和SVSV共同感染的虾中的作用的先前详细分析。 弧菌。在虾养殖场中,没有症状或死亡的WSSV感染可能导致虾变弱并可能引发VpA感染HPND.

我们还观察到被Vp感染的虾的抗氧化和抗过氧化酶降低AHPND,与我们正在进行的研究中的WSSV相似,我们怀疑Vp感染了AHPND 它也可能危害了动物,增加了它们对池塘中其他病原体的敏感性。

肌内(IM)途径已被广泛用于虾的WSSV实验感染。但是,IM注射尚未被认为是Vp的感染途径。AHPND。此外,每个操作系统喂食都会导致WSSV和Vp感染。AHPND,但这不是双重感染实验的实用方法,因为假定实验虾将在短时间内被感染两次。因此,对于当前的生物测定,我们选择了浸入(水基)方法与WSSV和Vp共同感染虾AHPND。 WSSV和WSSV之间已经确认了受相同感染途径影响的协同效应。 弧菌 spp。

透视

据我们所知,我们的研究是第一个检验WSSV和Vp共同感染的研究AHPND 在实验室条件下。在池塘中,感染WSSV(或其他病原体)的虾并不总是显示出临床体征或死亡率。在这些情况下,即使没有任何临床症状的WSSV阳性虾也可能比无病的对虾造成更高和更快的死亡率,并且虾在继发感染(如Vp)后几乎无法从疾病中恢复过来。AHPND.

另外,如本研究证实,继发感染将导致WSSV感染或病毒复制。因此,虾农必须注意管理其池塘中的多种感染(WSSV或其他病原体),以避免虾产量进一步损失。

原始出版物中提供了参考。


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