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病原性弧菌的现场诊断工具

迈克尔·金(Michael R. King)博士 索纳儿子 艾米·兰格(Amy M. Lange) 希瑟·贝恩 吉姆·布拉德利

了解各种细菌有助于改善管理实践

弧菌
α和β的溶血活性 弧菌 哈维 在血琼脂上培养。

致病性 弧菌 细菌是虾类行业的主要经济问题,每年在全球造成约30亿美元的损失。 创伤弧菌副溶血弧菌 在人类中引起严重的食源性疾病,其他物种也导致鱼类和贝类中的弧菌病暴发。

对虾对虾特别容易受到发光性弧菌病的影响 哈维坎贝利弧菌。这些 弧菌 虾是导致对虾泛滥的最重要病原体,是造成广泛疾病暴发的原因,死亡率高达100%。

现场样本问题

由于美国在水产养殖总产量中所占比例不到1%,因此对毒力的全球研究 弧菌 美国研究人员的要求是要运送海外样品。获得全景图的能力 弧菌 在运输过程中,样品降解或改变通常会阻碍虾生产系统中的虾类群落。

作者试图直接研究 弧菌 从生产者孵化场和池塘样本中确定 弧菌 与管理实践,压力源以及最终与病毒的关系,因此需要解决此运输难题的解决方案。此外,作者想区分病原 弧菌 以及虾水中常见的非致病物种。

常用但不准确的方法 弧菌 现场诊断是通过在硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖(TCBS)琼脂(一种广泛使用的差异培养基)上进行平板接种来区分强毒菌株和无毒菌株。人们通常会误认为,TCBS菌落颜色为绿色或黄色足以确定致病水平 弧菌 在水样中。但是,对于某些人来说,TCBS琼脂不是差异培养基 弧菌 种类,包括 哈维 以及其他蔗糖利用中的蔗糖利用变化,并且不能可靠地与其他蔗糖阳性或蔗糖阴性种类区分开。

FTA卡

寻求解决方案 弧菌 现场诊断的障碍,Whatman快速分析核酸(FTA)卡技术被评估为一种简化,保存稳定的收集方法,用于保存水样中的遗传物质而无需担心超低冷冻或快速运输等问题。

在FTA卡工艺中,细胞与FTA卡基质中的化学物质接触后会破裂,核酸会结合到FTA基质的纤维上。干燥存放时,这种遗传物质不会发生酶促降解或水解。

使用FTA卡法采集样品后,DNA已成功通过聚合酶链反应(PCR)扩增长达17年。如果在数周或数月的较短时间内使用,它可能会成为对偏远地区的野外样品进行PCR分析的有价值的工具。

有人认为,结合使用该卡和PCR扩增 弧菌 致病基因可能被证明对研究 弧菌 病原体在样品中的“潜力”,并将这种潜力与水环境中的管理实践和压力源相关联。

弧菌 研究

在作者对FTA卡采样方法的研究中,大阪府大学的S. Haldar博士开发了一种现有的PCR检测方法,用于区分 弧菌 坎贝利弧菌 哈维 通过靶向溶血素基因(hly)中的可变区来定位该物种,这是弧菌科中一种高度保守的毒力因子,其编码攻击细胞膜的溶血毒素,导致阴离子泄漏,细胞溶解和细胞死亡。

在这项研究中,使用多种来源的hly基因进行PCR 弧菌 遗传物质:分离自纯培养物的DNA 坎贝利弧菌哈维,与FTA卡结合的DNA掺入了 弧菌 在池塘水,生物絮凝液或干净的磷酸盐缓冲液中稀释的细胞,通过在每个反应管中插入FTA卡来扩增,或从相同的FTA卡洗脱并使用核酸提取柱纯化。

这些PCR测试一致地允许从低至100个检测毒力基因 弧菌 每个PCR反应中的细胞,以及污染最严重的生物絮凝样品中的所有细胞。无论采用纯核酸纯化的纯液体培养物的高质量模板DNA还是纯纯化培养物,虾塘水或缓冲液稀释的FTA结合DNA的高质量模板DNA,所用物种特异性PCR的灵敏度均保持在100个细胞/ PCR反应左右使用样品。

但是,与纯培养物中的检测相比,虾生物絮状液体样品中存在PCR抑制剂会降低100倍的检测率。 PCR抑制剂的作用通过重新纯化 弧菌 使用核酸提取方法从FTA卡中提取DNA,可对毒力基因进行检测,与加工后的纯培养物一致。

使用核酸纯化步骤,与使用直接FTA卡法进行的PCR反应相比,毒力基因检测灵敏度提高了约10倍。新鲜接种的FTA卡和暴露于涉及不同温度和潜伏期的海外运输模拟的FTA卡的PCR扩增之间几乎没有差异。带回家的消息:它有效!

毒素基因的表达

最初,研究人员仅使用微生物群落的DNA,然后试图质疑是否存在来自 弧菌 必然表明有致病潜力。如果基因从不表达怎么办?此外,由于许多基因组中具有多个拷贝数的基因,确定致病潜力的方法如何量化?

当前的工作涉及研究来自这些相同卡的RNA,初步结果表明这是非常有用的。实际上,早期的工作是研究上调这些表达的压力源 弧菌 毒素被证明是非常有趣的,但是需要进行更彻底的研究。作者还开发了定量PCR测试,以使这种方法更可靠,更灵敏且劳动强度更低。此外,他们的工作正在寻求扩大研究中有毒物种和毒力基因的数量。

 PCR检测
图1:区分多重PCR反应的结果 哈维坎贝利弧菌 使用高质量DNA(左)或FTA卡打孔机以物种特异性的hly基因引物加标不同浓度的 弧菌 单元格(右)。

要求现场样品

随着RNA和定量PCR工作的进行,该小组的下一步是开始研究 弧菌 来自国外的样品,最初用于方法开发的意图。现在,微生物发现小组将寻求愿意的虾生产者从其低产和高产池塘中将这些FTA卡上的核酸运输,以及与管理实践和水化学数据有关的完整调查表。收集这些数据将有助于科学界和虾生产者社区了解弧菌与管理实践,压力源以及对虾经济的影响有关。

观点

通过使用FTA卡作为偏远,海外或其他无法获取的水样的采样方法,可以保存采集时存在的生物群落的基因快照。基于FTA卡的采样技术以及基于DNA或RNA的毒力基因检测和定量方法可以成为监测艾滋病毒/艾滋病的重要工具 弧菌 潜在的毒力。

检测和理解差异的能力 弧菌 虾生产系统水样本的社区组成将使研究人员能够了解这些生物,池塘性能,管理实践和环境压力因素之间的关系。

(编辑’注意:本文最初发表于2014年5月/ 6月的 全球水产养殖倡导者