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基因组编辑潜力可改善水产养殖的繁殖,生产,第2部分

Remi L.Gratacap博士 安娜·沃格留斯 博士 罗尔夫·布鲁德维克·埃德瓦尔森博士 罗斯·休斯顿 教授,博士

加快遗传增益,技术挑战,公众和法规接受,观点

 基因组编辑
CRISPR / Cas9基因组编辑技术已成功应用于多种养殖物种,包括罗非鱼(左; Darryl Jory摄影)和channel鱼(右; Ryan Somma摄影,Wikimedia Commons)。

编辑’注意:本文是本指南的第2部分 原始出版物,此处进行了归纳和总结。 第1部分可以在这里找到.

在现有QTL上固定等位基因

检测和利用定量变异性状位点的致病变异[QTL;与生物体表型的数量性状变化相关的基因座(DNA片段)];通常是鉴定和测序导致性状变异的实际基因的早期步骤。影响生产性状是大多数动物育种和遗传学研究的基本目标,尽管迄今为止成功案例很少。模拟表明,与单独的系谱或基因组选择相比,作为育种计划的一部分,利用基因组编辑在多个QTL处寻找有利的致病性等位基因,具有加速遗传收获的潜力。

但是,有效应用此方法的主要挑战是成功识别QTL(尤其是效果较小的QTL)的致病变异。为了实现这一目标,可以将一套遗传和基因组技术应用于从大规模全基因组关联研究中鉴定出的候选变异的候选清单(图1)。可以使用相同的方法去除种群中不可避免的有害变异,包括大效应变异(例如隐性致死突变)和更多的多基因有害负荷。但是,多基因性状(一种表型受多个基因影响的性状)面临的挑战是,需要在同一亲虾动物中同时编辑多个等位基因,以使用这种方法产生显着影响,因此需要发展和改进需要多重基因组编辑(操纵多个基因)方法。

图1:结合体内和体外筛选方法来鉴定,测试和应用水产养殖物种中的抗病等位基因。体内筛选:(1)从鱼类的异质种群开始; (2)用目标病原体攻击; (3)耐药和易感动物的测序和/或基因分型; (4)大规模全基因组关联研究(GWAS)方法与功能和比较基因组学相结合,以检测商业水产养殖种群中天然存在的抗病等位基因。体外筛选:(1)汇集的CRISPR基因敲除(GeCKO)方法导致异质细胞群体; (2)在病原体攻击后进行阳性或阴性选择;以及(3)排序到; (4)筛选富集的引导(g)RNA可以发现新的抗病等位基因。然后将通过这两种方法中的一种或两种方法鉴定出的候选功能基因用于体外(5)和体内(6)的测试和表征,然后进行潜在的商业应用,从而导致动物群的抗病性明显提高(7)。

寻找与水产养殖生产相关的复杂性状的致病性变体的管道

筛选出QTL作为体内CRISPR / Cas9潜在靶点的潜在功能变体将需要大量研究工作,并且可能包括:(i)比较具有不同表型的动物的目标基因表达特性; (ii)在感兴趣的基因组区域内多态性的功能注释(在一个物种的种群中出现两种或两种以上明显不同的形态或形式,也称为替代表型); (iii)比较基因组学,包括该地区的系统发育(进化)保护; (iv)检测影响这些区域内候选基因座的基因表达的变体(例如,表达QTL或等位基因特异性表达)。

可以使用基因敲除和最终的“等位基因交换”实验的组合,使用同源基因定向修复(HDR;细胞修复双链DNA损伤的机制),在体内和体外测试靶向编辑对候选基因的影响。一个模板,用于在评估对目标表型的影响之前,将QTL上等位基因的不利版本更改为有利版本。这种技术流水线可以将QTL区域内成千上万的候选变体入围,直至可能的致病变体。鱼类基因组学技术的快速发展将极大地促进这一过程。例如,参考基因组装配现在可用于大多数水产养殖种类,并且现在的重点是改进这些装配,尤其是功能注释以发现功能相关区域(例如,开放染色质,启动子,增强子等)。

通过编辑渗入:获得不同菌株或物种的等位基因

基因组编辑的令人兴奋的可能性之一是在封闭的育种种群之外获得遗传变异,而无需进行昂贵且耗时的基因渗入[一种基因(基因流)从一个物种通过另一个物种进入另一个物种的基因库的运动)。种间杂种与它的一个亲本程序的重复回交,或在无法渗入的情况下。

通常,特定的农场动物品系或密切相关的物种具有理想的特性。如果可以识别出负责表型内或种间变异的等位基因,那么CRISPR技术可以潜在地编辑目标菌株和/或物种中的不利等位基因,使其与相关菌株或种类(即通过编辑渗入)。换句话说,它为绕开传统的基因渗入提供了新的机会,从而避免了连锁拖累所带来的不利影响(例如,与野生菌株渗入等位基因相关的对生长速率的负面影响),并且它允许获得其他菌株和物种的遗传变异使用常规的选育方法将无法做到这一点。

从务实的角度来看,这种通过编辑进行渗入的方法的早期应用将有希望对生产产生变革性影响,以证明需要进行大量的研发工作。在大西洋鲑鱼中,寄生co足类海虱(鲑鱼麻疯病 在北半球和 罗格斯干酪 在南半球)对可持续水产养殖的影响巨大,全球每年的经济影响超过8.8亿美元。水产养殖的一个独特方面是养殖物种与可能具有理想特征的野生物种和种群接近。例如,某些太平洋鲑鱼物种,例如银大麻哈鱼和粉红鲑鱼,对海虱有很大的抵抗力,并且能够对寄生虫进行成功的免疫反应。这增加了将耐药机制转移到大西洋鲑鱼的诱人可能性,并且已经进行了大量的研究工作来确定宿主耐药机制相对差异的潜在因素。

由于它们对海虱有明显的抵抗力,并且对海虱产生了成功的免疫反应,因此,银大麻哈鱼已经获得了关于将抗性机制转移到大西洋鲑鱼的可能性的大量研究工作。俄勒冈土地管理局和华盛顿合影。公共区域。

可能在通路中存在关键的调控基因,这些通路支撑着物种之间的抗性差异,可以在大西洋鲑鱼中进行修饰以模仿银大麻哈鱼对海虱的反应。这可以靶向编辑编码序列和/或调节调控序列以增强或抑制这些关键宿主应答基因的表达。但是,基因表达的时间和/或空间差异通常会对给定的性状产生重大影响,并且表达的整体修饰可能无法达到所需的效果。

基于特征知识创建从头变异

尽管基于现有遗传变异进行基因组编辑(在养殖品系中进行编辑,或通过基因渗入进行编辑)为动物生产中的重大惠益创造了可能,但从头创造了有利的等位基因(即与自然发生的基因不同的等位基因)据我们所知,等位基因是另一个令人兴奋的途径,已经为动物生产和福利问题提供了潜在的解决方案。在这种方法中,可以基于目的特征生物学的先验知识,或者从全基因组遗传扰动方法中识别影响该特征的候选基因,使用CRISPR / Cas9创建新的等位基因。前者的一个例子是猪对猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的抵抗力的发展,其中使用基因组编辑敲除CD163基因,导致有生存力的动物缺失了整个受体,或者通过去除而创造了修饰的受体特定的外显子及其相关的蛋白质结构域。

在水产养殖中也使用了类似的方法,包括修饰等位基因以诱导大西洋鲑鱼不育,并将mstn1基因靶向几种鱼类以增加生长。备选地,反向遗传筛选可以促进发现影响关注性状的从头等位基因。这样的全基因组CRISPR / Cas9筛选可以在细胞系中进行,并且可以提供从头靶向,用于下游测试和体内潜在的编辑,特别是对于疾病抗性性状。

混合CRISPR筛查抗病性

CRISPR / Cas9编辑出现后出现的最强大的技术之一是全基因组CRISPR敲除(GeCKO)方法。这包括创建一个数以万计的目标指导RNA(gRNA;工程CRISPR系统的两个组成部分之一)的文库,以靶向目标生物中的每个基因,然后进行合成,包装成慢病毒载体并转导细胞系以低剂量表达Cas9,目的是每个细胞大约整合一个gRNA。然后筛选细胞系(例如,使用病原体攻击),并对选定的细胞(存活,荧光标记或另一选择标记)进行测序。选择后,gRNA的富集或耗尽通知了靶基因在所研究表型中的作用。

水产养殖研究的一个主要瓶颈是缺乏适合许多目标物种的合适的,经过良好测试和特征化的细胞系。的确,对于许多甲壳类和软体动物物种,没有公认的永生化细胞系。开发这样的平台将使全基因组筛选方法在主要水产养殖物种中成为更现实的可能性。目前,尽管在细胞培养中的CRISPR / Cas9处于早期阶段,但仍处于形成阶段。

需要在水产养殖物种中优化体外基因组编辑的各个方面,包括用于大型插入片段的基因组整合的方法,以及用于驱动哪种gRNA在不同物种和系统中表达的启动子的优化方法。病毒感染(以及对这些感染的抵抗力)是使用CRISPR / Cas9进行体外研究的优先目标特征,因为宿主反应的先天机制通常是细胞内在的,因此可以在现有的永生化细胞系中进行审问。

开发这项技术将有助于促进大规模遗传筛选的整合,从而为支持抗病性的生物学提供信息,并为商业化水产养殖育种提供候选等位基因管道。 Cas9稳定靶标动物的产生可能促进易于编辑的原代细胞系的发展,以及永生化细胞系的未来发展(来自多细胞生物的细胞群体通常不会无限期增殖,但是由于突变而逃避了正常细胞的衰老因此,细胞可以从靶组织和/或细胞类型在体外长时间生长,从而将GeCKO方法的应用范围扩大到更广泛的水产养殖物种。

要克服的技术挑战

有几个重要的技术障碍需要解决,以最大程度地在水产养殖物种中应用基因组编辑方法。首先,在已经应用了CRISPR / Cas9的物种中,需要优化方法以最大化编辑效率,最小化脱靶效应并减少镶嵌问题(一个基因中存在两个或更多个具有不同基因型的细胞群)在F0代中从单个受精卵发育而来的个体。脱靶编辑可能导致基因组的非特异性和意外修饰,也可能导致对生物的意外影响。对水产养殖物种基因组序列的了解增加将有助于设计针对单个目标区域的gRNA,并且相对适度的全基因组重测序成本可以促进针对脱靶编辑事件的常规筛选。

为了快速选择最佳的gRNA,可以在体内编辑之前在细胞培养物中测试构建体。特别是对于难以获得新受精的胚胎的物种(例如某些虾类),可以测试CRISPR / Cas9的替代递送方法,包括精子介导的转移,未受精卵的显微注射和编辑原始生殖细胞。富集感兴趣的等位基因的另一种方法是将具有所需编辑的动物的生殖细胞移植到多个无菌替代物中。类似方法已成功地用于鸡的编辑中,将技能和技术从陆生牲畜和模型生物转移到水产养殖物种将是该方法成功的关键。

对于一些难以获得新受精的胚胎的虾类,可以测试CRISPR / Cas9的替代递送方法,例如精子介导的转移,未受精卵的显微注射以及编辑原始生殖细胞。费尔南多·韦尔塔摄。

影响公众和监管接受度的因素

技术创新对于促进粮食生产,满足日益增长的全球需求至关重要。 CRISPR / Cas9技术具有令人兴奋的潜力,可为全球海鲜生产的数量,质量和可持续性做出贡献。但是,公众和法规的接受是实现其潜力的关键。

关于基因修饰(GM)的定义以及基因组编辑方法是否应单独考虑,存在大量争论。如果单独考虑基因组编辑,则前面讨论的不同应用程序可能会受到不同法规的约束。例如,基因组编辑动物可以仅在其基因组中有一个碱基的变化就被创造出来,该变化对应于养殖和/或野生种群中现有的多态性。另外,据我们所知,可以创建自然界中不存在的从头等位基因。前者可能更容易为公众所接受,并可能受到较宽松的监管程序的约束。然而,欧洲法院关于将基因组编辑作物视为转基因生物的裁决可能会阻碍基因组编辑在欧盟农业物种中的商业规模应用。

但是,值得注意的是,转基因鲑鱼( 水族赏金 带有转基因生长激素基因的鲑鱼)已被FDA和加拿大食品检验局批准用于人类食用。此外,同一家公司从基因组编辑衍生的罗非鱼品系已在阿根廷免于转基因法规。显然,关于编辑动物法规的不确定性将长期存在,并且该过程在不同国家将有很大不同。

因此,与公众和其他利益相关者广泛合作以促进知识驱动的有关技术收益和风险的决策至关重要。从公众接受的角度来看,重要的是要考虑目标特征的性质,以及潜在利益是否超出了可持续的生产和利润范围。例如,不育等性状也对环境和野生种群具有下游益处,而抗病性等性状也对动物福利具有实质性同时利益。

观点

水产养殖是增长最快的粮食生产部门,比捕捞渔业的重要性正在迅速提高,被视为粮食和营养安全的重要组成部分,特别是在发展中国家。随着针对许多世界上最重要的水产养殖物种的高科技育种计划的发展,遗传学和育种技术在水产养殖中的使用正在迅速增加。大多数养殖的水生物种都接近野生祖先,这为开发水产养殖业可持续的海鲜生产提供了重要的未开发资源。此外,水产养殖物种的外部受精和高繁殖力为高分辨率遗传学研究提供了令人兴奋的机会,以了解和改善复杂性状。

CRISPR / Cas9等基因组编辑技术具有极大的潜力,可加快生产性状的遗传增益。传染病是水产养殖生产的主要限制之一,因此是选择性育种和基因组编辑方法的主要目标。宿主对某些病原体的抗性是适合使用基因组编辑技术的性状,因为它难以在育种候选者中进行非破坏性测量,很难利用细胞培养全基因组汇集的CRISPR筛查方法,而且早期的频繁使用生活在体内建立的挑战模型。

基因组编辑应用的不同类别包括:(i)发现影响感兴趣特征的单个或多个QTL的致病变异,以及随后通过编辑固定有利的等位基因; (ii)通过将有利的等位基因编辑进入其他种群,品系或物种的封闭育种系统进行渗入; (iii)创建和使用对感兴趣的性状有积极影响的从头等位基因。基因组编辑以及已建立的遗传和基因组方法可以检测和筛选候选功能性变体,以进行下游体内验证和潜在的商业应用。

尽管几个突出的研究重点需要大量努力,但大多数水产养殖物种的高繁殖产量将使引入良好管理的育种计划种质中的潜在有利等位基因能够以在陆生养殖动物生产中不可行的规模和速度传播。因此,在良好的监管和公众认知之下,基因组编辑技术具有通过水产养殖显着改变海鲜可持续生产的潜力。


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