关于水产养殖演变的新闻特征和技术文章,是世界上增长最快的行业之一。

新的嵌套PCR试验靶基因特异于养殖虾病原体EHP

杰恩汉班,DVM,Ph.D. 凯西F.J. Tang.,Ph.D. 吉承金,博士。

用于常规诊断和低级感染检测

虾疾病EHP.
该研究开发了一种嵌套的PCR方法,其使用特异于EHP的β-小管蛋白基因序列,可用于常规诊断。

微孢子渣 肠细胞肝病肝癌 (EHP)感染Penaeid虾,被认为是对虾水产养殖的关键威胁,在若干亚洲国家的虾农场造成严重的经济损失。靶器官包括肝癌和中肠,因此EHP感染会影响消化和吸收功能,导致生长迟缓。虾可以通过摄入同学或通过喂养EHP受污染的活饲料的EHP感染。

ehp. 诊断方法靶向SSU rRNA序列

已经基于小亚基(SSU)RRNA开发了几种EHP诊断方法,包括PCR,QPCR, 原位 杂交,环介导的等温扩增测定。然而,SSU rRNA序列在鉴别的微孢子虫和基于SSU RRNA的PCR方法中不具有高度特异性,可以在非虾样品中产生误报。例如,EHP’SSU RRNA序列与此共享90%相似之处 肠孢菌癌症 感染海洋螃蟹。因此,EHP诊断需要更具体的PCR方法。

靶向EHPβ-小管蛋白基因的新型EHP诊断方法

因此,我们开发了一种新的EHP诊断方法,其基于β-小蛋白基因序列(Genbank No.KX842357,表1)设计了两组引物。

韩,EHP检测,表1

底漆名称序列(5'至3')扩增子大小(BP)
β-管蛋白第1步PCR
ehp. -618F.cagctggttgaaaatgcaaa.618
ehp. -618R.gtgcaaaaatgcctttcgtt.618
β-管蛋白第2步(嵌套)PCR
ehp. -237F.gatatgcgcctctgtgtca.237
ehp. -237R.tgtttgaatccactcgaca.237
表1.用于肠细胞肝肝癌(EHP)检测的PCR引物。

在下列循环条件下用引物EHP-618F / R进行第一步PCR:在94摄氏度下初始变性3分钟,然后在94摄氏度的35次循环30秒,58度-C 30秒和72度-c 30秒,并在72度-c的最终延伸7分钟。

然后,在下列循环条件下用内部引物EHP-237F / R进行第二步(嵌套)PCR:初始变性在94摄氏度下3分钟,其次为30℃,30℃为30秒,58摄氏度30秒,72摄氏度为30秒,最终延伸为72度-c,7分钟。

第二步骤(嵌套)PCR比第一步PCR(图1)更敏感,因此适用于检测低水平的EHP感染。

图。1:通过在100ng /μl的起始浓度下通过10倍稀释(来自10-1至10-5)的10倍稀释(从10-1至10-5)测定的第一步骤和第二步(嵌套)PCR之间的敏感性比较。

现场样品研究 - 第一步PCR测定

为了比较现场样品中的敏感性,我们应用了来自东南亚国家(越南,印度,泰国和印度尼西亚)和EHP阳性盐水虾Artemia SPP的几种EHP感染的虾样本(n = 22)。 (n = 6;所有在成人阶段)由EHP SSU rRNA PCR确定(PCR产物对应于kp759285)到第一步PCR测定。在第1步PCR之后,来自来自以上各国的各种虾农场的所有EHP样品(n = 22)产生618-BP扩增子(图2)。

图。图2:由靶向β-微管蛋白基因的第一步PCR测定产生的代表性扩增子。来自印度,越南和泰国样品的618个BP扩增子,但扩增子不是从Artemia SPP产生的。通过第一步PCR样品。

第一步PCR测定简单且快速。然而,它没有产生来自EHP阳性壁血症生物量(n = 6)的任何扩增子,这可能是由于这些样品中存在的低量EHP(图2)。

现场样品研究 - 第二步(嵌套)PCR测定

图3:由靶向β-小蛋白基因的第二步(嵌套)PCR测定产生的代表性扩增子。来自EHP阳性Artemia样品的237 BP扩增子。

在第二步(嵌套)PCR之后,在所有EHP样品(N = 22)中观察到237-BP的DNA片段,包括来自蒿属生物质样品的那些(图3)。通过该嵌套的PCR方法获得的诊断结果有利于监测虾的虾,具有低水平的EHP感染。此外,该方法有助于检测活饲料中的EHP(如蒿血症),这在该领域很重要,因为活饲料是EHP感染的潜在风险。

透视

在这项研究中,我们使用β-微管蛋白基因序列开发了一种嵌套的PCR方法。这种新的PCR方法特定于EHP,可用于例行诊断。此外,该方法可用于检测低级EHP感染。此外,我们通过这种嵌套的PCR方法检测到Artemia样本中的EHP。它表明EHP从活饲料转移到虾仁湾的可能性。在田野中,通过喂养雾血症等EHP受污染的活饲料,可以通过EHP感染虾。需要进一步的实验室实验来弄清楚EHP感染的植物中EHP感染的蒿血症的感染性。


现在你'完成阅读文章......

… 我们  希望你能考虑支持我们的使命,以记录全球水产养殖业的演变,并每周分享我们广大贡献者的广大贡献者网络。

通过成为全球水产养殖联盟成员,您可以确保我们通过会员福利,资源和活动所做的所有竞争性工作。个人成员每年只需50美元。 Gaa个人和公司成员可以在4月开始互动访问一系列目标虚拟事件。立即加入。

不是gaa会员?加入我们。