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新的巢式PCR测试针对养殖虾EHP病原体的特定基因

韩德恩(Dee Eun Han),DVM博士 唐凯(Kathy F.T. Tang)博士 金智亨博士

用于常规诊断和检测低度感染

ElPatógenoEHP
这项研究开发了一种巢式PCR方法,该方法使用对EHP特异的β-微管蛋白基因序列,可用于常规诊断。

微孢子虫 肝小肠肠杆菌(EHP)感染了皮虾,被认为是对虾养殖的重大威胁,在一些亚洲国家给虾养殖场造成了严重的经济损失。目标器官包括肝胰腺和中肠,因此EHP感染会影响消化和吸收功能,从而导致生长迟缓。食人鱼或食用被EHP污染的活食,虾可能会感染EHP。

针对SSU rRNA序列的EHP诊断方法

已经开发了各种基于rRNA的HPE小诊断(SSU)诊断方法,包括PCR,qPCR,杂交 原位和等温回旋介导的扩增分析。但是,SSU rRNA序列对微孢子虫的检测不是很特异性,基于SSU rRNA的PCR方法可能会在非虾样品中产生假阳性。例如,EHP的SSU rRNA序列与AHP的SSU rRNA具有90%的相似性。 肠杆菌会传染海蟹。因此,对于HPE的诊断需要更具体的PCR方法。

针对EHPβ-微管蛋白基因的EHP新诊断方法

因此,我们开发了一种新的诊断HPD的方法,该方法使用了两组基于β-微管蛋白基因的序列设计的引物(GenBank No. KX842357,表1)。

汉,EHP技术,塔布拉1

Nombre del cebadorSecuencia(5’至3’)Tamañodeamplicón(bp)
β微管蛋白1er-paso 聚合酶链反应
环保计划-618FCAGCTGGTTGAAAATGCAAA618
环保计划-618RGTGCAAAAATGCCTTTCGTT618
β-tubulina2do-paso 聚合酶链反应(anidado)
环保计划-237F加特加CGCCTCTGTGTTTTCA237
环保计划-237RTGTTTGGAATCCACTCGACA237
表1.用于检测肝小肠肠杆菌(EHP)的PCR引物。

在以下循环条件下,用EHP-618F / R引物进行首轮PCR:在94°C初始变性3分钟,然后在35个循环中于94°C变性30秒,在58°C变性30次秒和72摄氏度持续30秒,最后扩展到72摄氏度持续7分钟。

然后,在以下循环条件下,使用EHP-237F / R内部引物进行第二次(嵌套)PCR:在94摄氏度下初始变性3分钟,然后在94摄氏度下进行20个循环30秒,在58摄氏度下持续30秒和72摄氏度下持续30秒,最后在72摄氏度下扩展7分钟。

第二遍(嵌套)PCR的灵敏度是第一遍PCR的100倍(图1),因此适合检测低水平的EHP感染。

图1:通过第一步浓度为100 ng /μl的EHP阳性DNA的10倍稀释(10-1至10-5)稀释而确定的PCR第一步和第二步(嵌套)之间的灵敏度比较。

现场样品研究-首过PCR测定

为了比较田间样品的敏感性,我们采用了从东南亚国家(越南,印度,泰国和印度尼西亚)采集的EHP感染虾(n = 22)和卤水虾Artemia spp的几个样品。通过EHP的SSU RNA的PCR检测到的EHP阳性(n = 6;全部处于成年期)(PCR产物对应于保藏号KP759285)。在PCR的第一阶段之后,从上述国家(图2)的各个虾场的所有EHP样品(n = 22)中产生了618 bp的扩增子。

图2:通过针对β-微管蛋白基因的首过PCR分析产生的代表性扩增子。来自印度,越南和泰国样品的618 bp扩增子,但不是从卤虫属物种的样品中产生的。通过首过PCR。

首过PCR检测简便,快速。但是,它没有从EHP阳性盐水虾生物质样品(n = 6)中产生任何扩增子,这可能是由于这些样品中EHP含量较低(图2)。

现场样品研究-第二步(嵌套式)PCR分析 

图3:通过针对β-微管蛋白基因的第二次(嵌套)PCR分析生成的代表性扩增子。来自EHP阳性盐水虾样品的237 bp扩增子。

经过第二步(嵌套)PCR后,在所有EHP样品(n = 22)中均观察到237 bp的DNA片段,包括盐水虾生物质样品中的片段(图3)。通过这种嵌套式PCR方法获得的诊断结果对于监测EHP感染水平较低的虾是有益的。此外,该方法对于检测活食(例如盐水虾)中的EHP非常有用,这在现场非常重要,因为活食具有EHP感染的潜在风险。

透视

在这项研究中,我们开发了一种使用β-微管蛋白基因序列的巢式PCR方法。这种新的PCR方法特定于HPS,可用于常规诊断。同样,此方法对于检测低度EHP感染也很有用。此外,我们使用这种巢式PCR方法在卤水虾样品中检测到EHP。说明了EHP从活饲料转移到虾亲鱼的可能性。在野外,虾可能会被以EHP污染的活食(例如盐水虾)为食而感染EHP。还需要其他实验室实验以确定虾中EHP感染的盐水虾的感染性。


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