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聚合酶链反应方法表征AHPND V.p分离株

韩智恩博士 唐凯(Kathy F.T. Tang)博士 唐纳德·莱特纳(Donald V.Lightner)博士

重大虾病管理监测战略发展进展

聚合酶链反应
急性肝胰腺坏死病(AHPND)也被称为早期死亡率综合症(EMS),严重影响了一些国家的养殖虾。这项研究的结果将有助于制定管理监测策略,以限制该病的传播并减少其对商品虾养殖场的影响。

 

本研究从AHPND的全基因组序列中分析了质粒序列 副溶血弧菌 (副总裁)-一种严重的虾病-分离并鉴定出质粒内明显的地理变异,并开发了表征AHPND的PCR方法 Vp 分离株为墨西哥型或东南亚型。AHPND毒力质粒中地理序列变异的发现可用作监测该病传播的标记。

在这项研究中,我们分析了携带该病毒的大毒力质粒中的序列变异 irir像毒素基因 副溶血性弧菌 引起急性肝胰腺坏死病(AHPND)的分离株。我们发现了一个可变区(4,243-bp),对应于AHPND分离株的地理采集位点。然后,我们开发并应用了双链PCR检测法,可用于诊断AHPND,并进一步区分从各个地理区域收集的致病性AHPND菌株。

AHPND毒力质粒的序列变异

我们比较了9个地理菌株(表1中列出的全基因组序列GenBank号)在毒力质粒(pVPA3-1)中的序列变异。从AHPND-的全基因组序列(WGS)中鉴定并组装了这些毒性质粒的序列副溶血弧菌 通过爆炸分析。在墨西哥AHPND-副溶血弧菌 菌株(M0605和FIM-S1708 +),Tn3样转座子是插入pVPA3-1 ORF4的4243 bp片段。但是,在从东南亚(包括越南,中国和泰国)收集的7种AHPND菌株中未发现此片段(表1,图1)。

隔离GenBank编号产地(年)Tn3样转座子
13-028 / A3JOKE00000000越南(2013)-(WGSa& 聚合酶链反应b)
NCKU_CV_CHNJPKU00000000中国(2010)-(WGS)
NCKU_TV_3HPJPKS00000000泰国(2013)-(WGS)
NCKU_TV_5HP日版泰国(2013)-(WGS)
TUMSAT_DE1_ S1 BAVF00000000泰国-(WGS)
TUMSAT_DE1_ S2BAVG00000000泰国-(WGS)
TUMSAT_ D06_ S3BAVH00000000泰国-(WGS)
M0606杰尔00000000墨西哥(2013)+(WGS)
FIM-S1708 +(1个隔离区*)JPLV00000000墨西哥(2014)+(WGS& 聚合酶链反应
13-306 / D4(1个隔离区*)不适用 墨西哥(2013)+(PCR)
13-511 / A1(1个隔离区*)不适用 墨西哥(2013)+(PCR)
14-231(3个分离株*)不适用 墨西哥(2014)+(PCR)
14-450(7个分离株*)不适用 墨西哥(2014)+(PCR)
12-194G(1个隔离区*)不适用 越南(2012)-(PCR)
14-188(5个菌株*)不适用 越南(2014)-(PCRb)
14-090(7个分离株*) 不适用 越南(2013)-(PCR)
13-313(2个样本#)不适用 国家#1(2013)+(PCR)
14-433(3个样本#)不适用 国家#2(2014)+(PCR)
15-133(6个样本#)不适用 国家#2(2015)+(PCR)
12-296(4个样本#)不适用 越南(2012)-(PCR)

墨西哥AHPND分离株中的Tn3样转座子

要确定是否仅在AHPND-中找到Tn3样转座子副溶血弧菌 在墨西哥收集的分离物中,我们选择了一对PCR引物MX-345F(5’-TACCAGCTCTAACAAGGCCA)和MX-345R(5’-AACGTTCCAAGGAGTCGAGT)从我们收集的AHPND分离物中扩增DNA(表1)。正向引物位于Tn3样转座子的上游,反向引物位于Tn3样转座子的内部(图1)。用以下参数进行扩增:94℃的起始变性oC进行3分钟,然后进行35次循环,每次94次oC持续30 s,60oC 30秒和72oC持续30 s,最后扩展到72oC持续7分钟。我们在29种AHPND-纯培养物中应用了该PCR副溶血弧菌 分离株,结果表明,墨西哥的所有12种分离株均存在Tn3样转座子,而越南的13种AHPND分离株均没有Tn3转座子阳性(表1)。

AHPND
图1.急性肝胰腺坏死病(AHPND)毒力质粒中Tn3样转座子的示意图。末端的数字表示墨西哥菌株M0605的contig044中的核苷酸位置,以及越南菌株13-028 / A3中携带的质粒pVPA3-1。

亚洲AHPND分型PCR

在pVPA3-1的ORF4内的Tn3样转座子之外选择的另一对PCR引物Asia-482F(5'-TGAACCGTTCCTCATGCTCT)和Asia-482R(5'-TCAAAGCAGCCCAGACAAAC)被用于检测越南的AHPND分离株。来自东南亚的分离株的扩增子大小预计为482-bp(图1)。结果显示,来自越南的AHPND分离株的全部13种纯培养物均为阳性,而墨西哥的13种分离株均无阳性。这些引物也可以与墨西哥分离株退火,但扩增子的大小将为4732-bp,使用所用的PCR循环图谱未检测到PCR产物。

用于诊断和键入AHPND的双链PCR

为了同时检测AHPND和质粒分型,使用2对引物—MX-345F / R(或Asia-382F / R)和VpPirA-284F(5’-TGACTATTCTCACGATTGGACTG)/ 副总裁PirA-284R(5’- CACGACTAGCGCCATTGTTA)—在PCR过程中将其加入单个管中。用上述循环图谱进行扩增。如预期的那样,所有细菌培养物均显示284bp的条带,表明存在毒素基因。从墨西哥分离的细菌培养物也显示了一个345 bp的条带,表明存在Tn3样转座子。相反,越南AHPND分离株在482 bp处显示一条条带,表明不存在类似Tn3的转座子(图2)。

图2. 2012年至2015年在墨西哥和越南收集的样品中的副溶血性弧菌急性肝胰腺坏死病(AHPND)病原菌的双重PCR检测和分型。从墨西哥(A)和越南(B)的受感染虾中分离出的纯细菌培养物);从拉丁美洲(C)和越南(D)收集的被感染虾肝胰腺组织中提取的DNA。
图2.急性肝胰腺坏死病(AHPND)病原分离株的双重PCR检测和分型 副溶血弧菌 从2012年至2015年在墨西哥和越南采集的样品中进行分离。从墨西哥(A)和越南(B)的受感染虾中分离出纯细菌培养物;从拉丁美洲(C)和越南(D)收集的被感染虾肝胰腺组织中提取的DNA。

为了验证这一点,我们将双工方法应用于从AHPND感染虾肝胰腺组织中提取的15个DNA样品。从拉丁美洲国家的农场收集了11只虾,从越南的农场收集了4只虾。对于拉丁美洲样品,双链PCR显示345-bp和284-bp的条带(图2),表明这些虾感染了AHPND致病菌,如284-bp的条带所示,并且这些细菌含有Tn3样转座子。对于从越南收集的4个样品,双链PCR产生了482-bp和284-bp的条带(图2),表明感染了没有Tn3样转座子的AHPND细菌。因此,此处描述的双工方法可用于快速诊断和分型从池塘收集的受感染虾的AHPND细菌。

墨西哥和越南分离株之间的毒力比较

即使它在 V. 副溶血性 T3样转座子似乎与毒力程度无关。我们感染了 南美白对虾 墨西哥(13-511 / A1)和越南(13-028 / A3)分离株都在实验室生物测定中。水族馆(3-L)充满了25 ppt的盐度的人造海水,水温保持在28°C。然后是无特定病原体(SPF) 南美白对虾 (平均重量:1克)放到水族馆中并喂食 副溶血弧菌 13-028 / A3和13-511 / A1分别与虾饲料混合。细菌长到1×109 CFU / mL并与虾饲料以1:1的比例混合。到第3天,在两种分离物中都可以看到100%的累积死亡率(图3)。

图3.毒力比较。在实验室生物检测中,虾(南美白对虾)感染了墨西哥AHPND分离株(13-511 / A1)和越南AHPND分离株(13-028 / A3)。 3天之内,所有虾都垂死或死亡,墨西哥和亚洲分离株之间的AHPND毒力无显着差异。
图3.毒力比较。虾 (南美白对虾)在实验室生物测定法中被感染了墨西哥AHPND分离株(13-511 / A1)和越南AHPND分离株(13-028 / A3)。 3天之内,所有虾都垂死或死亡,墨西哥和亚洲分离株之间的AHPND毒力无显着差异。

 

虽然遗传变异的功能之间的地理分离 V. 副溶血性 仍然是未知的,序列变异例如转座子的存在与否可以用作检测新暴发起源的有用标记。主要的变化是在墨西哥和拉丁美洲的分离株中存在Tn3样转座子,而在亚洲分离株中却不存在。这表明墨西哥和拉丁美洲的分离株具有共同的起源。此外,这将有助于制定管理监测策略,以限制该病的传播并减少其对商品虾养殖场的影响。