有关世界上发展最快的产业之一水产养殖发展的新闻报道和技术文章。

基因组编辑潜力,以改善水产养殖的繁殖和生产,第二部分

Remi L.Gratacap博士 安娜·沃格留斯博士 罗尔夫·布鲁德维克·埃德瓦尔森博士 罗斯·休斯顿教授,博士

加速遗传增益,技术挑战,公众和法规接受度以及前景

基因组编辑
CRISPR / Cas9基因组编辑技术已成功应用于多种养殖物种,包括罗非鱼(左; Darryl Jory摄影)和channel鱼(右; Ryan Somma摄影,Wikimedia Commons)。

编者注:本文是该文章的第2部分 原始帖子, 改编和总结在这里。 第1部分可以在这里找到.

修复现有QTL中的等位基因

数量性状基因座的因果变异的检测和使用[QTL;与生物体表型的数量性状变化相关的基因座(DNA片段)通常是鉴定和测序引起该性状变化的实际基因的第一步。影响生产性状是大多数遗传和畜牧业研究的基本目标,尽管迄今为止成功案例很少。模拟表明,与单独的系谱或基因组选择相比,将基因组编辑用于多个QTL中有利的因果等位基因作为育种计划的一部分具有加速遗传增益的潜力。

但是,有效应用此方法的主要挑战是成功识别QTL(尤其是影响较小的QTL)的因果变异。为了实现这一目标,可以将一套遗传和基因组技术应用于从大规模的基因组关联研究中鉴定出来的候选变体的候选清单(图1)。可以使用相同的方法消除种群中不可避免的有害变异,包括高效变异(例如致命的隐性突变)和更多的多基因有害负荷。但是,多基因性状(一种表型受一个以上基因影响的性状)面临的挑战是需要在同一繁殖动物中同时编辑多个等位基因,以使用这种方法实现显着影响。和增强需要多种基因组编辑方法(可操纵多个基因)。

图1:结合体内和体外筛选方法来鉴定,测试和应用水产养殖物种中的抗病等位基因。体内筛选:(1)从鱼类的异质种群开始; (2)用目标病原体攻击; (3)对易感和易感动物进行测序和/或基因分型; (4)大规模基因组关联研究(GWAS)方法与功能和比较基因组学相结合,以检测商业水产养殖种群中的自然抗病等位基因。体外测试:(1)汇集的CRISPR清除方法(GeCKO)导致细胞异质群体; (2)在病原体攻击后进行阳性或阴性选择;以及(3)排序a; (4)筛选(g)富集的RNA或(g)可以发现新的抗病等位基因的RNA。通过一种或两种方法鉴定的候选功能基因会继续用于体外(5)和体内(6)的测试和表征,然后潜在地进行商业应用,从而导致对该动物具有抗药性的动物种群疾病显着增加(7)。

发现与水产养殖生产相关的复杂性状的因果变异的渠道

预先筛选潜在的QTL作为体内CRISPR / Cas9潜在靶标的功能性变异体将需要大量的研究工作,并且可能包括:(i)比较来自具有不同表型的动物的基因表达的相关特征; (ii)在感兴趣的基因组区域内多态性的功能注释(在一个物种的种群中出现两种或两种以上明显不同的形式或形态,也称为替代表型); (iii)比较基因组学,包括该地区的系统发育(进化)保护; (iv)检测影响这些区域内候选基因座的基因表达的变体(例如,QTL表达或等位基因特异性表达)。

特定基因编辑对候选基因的影响可以使用基因敲除基因的组合在体内和体外进行测试,并最终进行“等位基因交换”在评估对目标表型的影响之前,使用同源直接修复(HDR;细胞中修复双链DNA损伤的机制)作为模板,将QTL中等位基因的不利版本改变为有利版本。这种技术范围可以列出QTL区域内的数千种候选变体,直至可能的因果变体。鱼类基因组技术的迅速发展将极大地促进这一过程。例如,现在大多数水产养殖物种都可以使用参考基因​​组装配,现在的重点是改进这些装配,尤其是功能注释以发现功能相关区域(例如开放染色质,促进剂,增强剂等)。

通过编辑渗入:获得不同菌株或物种的等位基因

基因组编辑的令人兴奋的可能性之一是在封闭的育种种群之外获得遗传变异,而无需进行昂贵且耗时的基因渗入[基因从一个物种到另一个物种的移动(基因流)。种间杂交种与其亲本程序之一的反复回交,或在无法进行基因渗入的情况下,通过另一个种的基因库获得]。

特定的农场动物品系或密切相关的物种通常具有理想的特性。如果可以识别出负责表型内或种间变异的等位基因,那么CRISPR技术可能允许对目标菌株和/或物种中的不利等位基因进行编辑以对应于相关菌株或种类(即每次编辑都渗入)。换句话说,它为避免传统的基因渗入提供了新的机会,从而避免了与链接拖曳相关的弊端(例如,与野生菌株等位基因渗入有关的对生长速率的负面影响),并允许获取使用常规的选择性育种方法不可能实现的其他品系和物种的遗传变异。

从务实的观点来看,这种渐渗法的早期应用将需要显示出对生产产生变革性影响的希望,以证明需要进行大量的研发工作。在大西洋鲑鱼中,寄生的pe足类海虱( 鲑鱼麻疯病 在北半球和 罗格斯干酪 在南半球)对可持续水产养殖产生毁灭性影响,全球每年产生超过8.8亿美元的经济影响。水产养殖的一个独特方面是耕种物种与可能具有理想特征的现有野生物种和种群接近。例如,某些太平洋鲑鱼,例如银大麻哈鱼和粉红鲑鱼,对海虱有很大的抵抗力,可以对寄生虫产生成功的免疫反应。这增加了将抗性机制转移到大西洋鲑鱼的诱人可能性,并且已经进行了大量的研究工作来确定宿主抗性机制中相对差异的潜在因素。

由于其对海虱的显着抵抗力以及对海虱的成功免疫反应的发展,银大麻哈鱼已就将抗药性机制转移至大西洋鲑鱼的可能性进行了大量研究。俄勒冈州和华盛顿土地管理局的照片。公共区域。

可能在途径中有关键的调控基因支持物种之间的差异抗性,可以在大西洋鲑鱼中进行修饰以模仿银大麻哈鱼对海虱的反应。可以指导编码序列的编辑和/或调节序列的调节,以增强或抑制这些关键宿主应答基因的表达。但是,基因表达的时间和/或空间差异通常会对给定的性状产生重大影响,并且表达的一般修饰可能无法达到所需的效果。

基于特征知识创建从头变异

基于现有遗传变异的基因组编辑(在培养的菌株内,或通过编辑的基因渗入)为动物生产带来更大利益的可能性,创造了有利的从头等位基因(即那些(据我们所知)与自然存在的等位基因截然不同)是另一个令人兴奋的途径,并且已经为动物生产和福利问题提供了可能的解决方案。在这种方法中,可以基于目的性状生物学的先验知识,使用CRISPR / Cas9或基因组相关的遗传扰动方法来识别影响性状的候选基因,从而使用CRISPR / Cas9创建新的等位基因。前者的一个例子是猪对猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的抵抗力的发展,其中使用基因组编辑去除CD163基因,从而导致缺乏该受体的存活动物。通过去除特定的外显子及其相关的蛋白质结构域来完成或创建修饰的受体。

在水产养殖中也使用了类似的方法,包括修饰等位基因以诱导大西洋鲑鱼不育,并将mstn1基因靶向几种鱼类以增加生长。备选地,反向遗传筛选可以促进发现影响关注性状的从头等位基因。这样的全基因组CRISPR / Cas9筛选可以在细胞系中进行,并且可以提供从头靶向,以供进一步测试和体内潜在编辑,尤其是抗病性状。

CRISPR筛选聚集抗病性

CRISPR / Cas9编辑时代到来的最强大的技术之一是全基因组CRISPR缺失方法(GeCKO)。这涉及创建一个数以万计的靶标指导RNA(gRNA;工程CRISPR系统的两个组件之一)的文库,以靶向靶标生物中的每个基因,然后进行合成,包装成慢病毒载体并转导以低剂量表达Cas9的细胞系,目的是每个细胞大约整合一次gRNA。然后分析细胞系(例如,使用病原体攻击),并对选定的细胞(存活的,荧光标记的或其他选择的标记)进行测序。选择后,gRNA的富集或耗竭告知目标基因在所研究表型中的作用。

水产养殖研究的一个主要瓶颈是缺乏足够的,经过充分测试和表征的许多感兴趣物种的细胞系。实际上,对于许多种类的甲壳类和软体动物,没有公认的永生化细胞系。这种平台的发展将使全基因组检测方法在主要水产养殖物种中成为更现实的可能性。目前,细胞培养中的CRISPR / Cas9处于鱼类物种的形成阶段,尽管有希望的早期结果。

需要在水产养殖物种中优化体外基因组编辑的几个方面,包括用于大型插入片段的基因组整合的方法以及用于驱动不同物种和系统中gRNA表达的启动子的优化方法。病毒感染(以及对这些感染的抵抗力)是使用CRISPR / Cas9进行体外研究的高度优先目标特征,因为宿主的先天反应机制通常是细胞固有的,因此易感染在现有的永生细胞系上进行审问。

这项技术的发展将有助于促进大规模遗传展示的整合,从而为支撑抗病性的生物学提供信息,并为商业化水产养殖提供候选等位基因管道。稳定的Cas9靶标动物的产生可能促进易于编辑的原代细胞系的发展,以及永生化细胞系的未来发展(来自多细胞生物的细胞群体通常不会无限期增殖,但由于突变而逃避了人类的攻击。正常的细胞衰老,并且可能继续分裂。因此,细胞可以从靶组织和/或细胞类型在体外长时间生长,从而使GeCKO方法的适用范围扩大水产养殖种类。

要克服的技术挑战

为了最大程度地在水产养殖物种中应用基因组编辑方法,必须解决几个重要的技术障碍。首先,在已经应用了CRISPR / Cas9的物种中,需要优化方法以最大化编辑效率,最小化脱靶效应并减少镶嵌问题(存在两个或更多个具有基因型的细胞群)在F0代中从单个受精卵发育而来的个体不同。脱靶编辑可能导致非特异性和非特异性基因组修饰,也可能对人体造成不良影响。更好地了解水产养殖物种的基因组序列将有助于设计单个目标区域的特定gRNA,并且相对适度的全基因组重测序成本可以促进常规筛选脱靶编辑事件。 。

为了快速选择最佳的mRNA,可以在体内编辑之前在细胞培养物中测试构建体。特别是对于难以获得新受精的胚胎的物种,例如某些虾类物种,可以尝试其他CRISPR / Cas9递送方法,包括精子介导的转移,未受精卵的显微注射和原始生殖细胞编辑。富集感兴趣的等位基因的另一种方法是将具有所需编辑的动物生殖细胞移植到多种无菌替代物中。类似的方法已成功地用于鸡的编辑中,将技能和技术从陆生牲畜和模型生物转移到水产养殖物种将是该方法成功的关键。

对于一些难以获得新鲜受精胚胎的虾类,可以尝试其他CRISPR / Cas9递送方法,例如精子介导的转移,未受精卵的显微注射和原始生殖细胞编辑。费尔南多·韦尔塔摄。

影响公众和监管接受度的因素

技术创新对于提高粮食生产以满足日益增长的全球需求至关重要。 CRISPR / Cas9技术具有令人兴奋的潜力,可为改善全球海鲜生产的数量,质量和可持续性做出贡献。但是,公众和法规的接受是实现其潜力的关键。

关于基因修饰(GM)的定义以及基因组编辑方法是否应分开考虑,存在大量争论。如果单独考虑基因组编辑,那么上面讨论的不同应用程序可能会受到不同法规的约束。例如,可以在基因组中仅具有单碱基变化的基因组编辑动物中创建这种动物,这些变化对应于农场和/或野生种群中的现有多态性。另外,据我们所知,可以重新创建自然界中不存在的等位基因。前者可能更容易为公众所接受,并可能受到较宽松的监管程序的约束。但是,欧洲法院关于将基因组编辑的作物视为转基因生物的决定可能会使以商业规模将基因组编辑应用于欧盟种植的物种变得困难。

但是,值得注意的是,转基因鲑鱼( 水上赏金 含有转基因生长激素基因)已被FDA和加拿大食品检验局批准用于人类食用。此外,同一家公司从基因组编辑衍生的罗非鱼品系已在阿根廷免于实施基因改造。显然,关于编辑动物的监管将存在长期的不确定性,并且该过程在不同的国家将有很大的不同。

因此,与公众和其他利益相关者的广泛接触对于促进基于知识的技术收益和风险决策至关重要。从公众接受的角度来看,重要的是要考虑目标特征的性质以及潜在的利益是否超出了可持续的生产和利润。例如,不育等性状对环境和野生种群也有下游益处,而抗病性等性状也对动物福利具有实质性同时利益。

观点

水产养殖是增长最快的粮食生产部门,比捕捞渔业的重要性迅速提高,被认为是粮食和营养安全的重要组成部分,特别是在发展中国家。随着针对许多世界上最重要的水产养殖物种的高科技育种计划的发展,遗传学和育种技术在水产养殖中的使用正在迅速增加。大多数养殖的水生物种都接近野生祖先,这为增强水产养殖贝类的可持续生产提供了重要的未开发资源。此外,外部施肥和水产养殖物种的高繁殖力为高分辨率遗传研究提供了有趣的机会,以了解和改善复杂的性状。

CRISPR / Cas9等基因组编辑技术具有极大的潜力,可以加速生产性状的遗传获得。传染病是水产养殖生产的主要制约因素之一,因此是选择性育种和基因组编辑方法的重要目标。宿主对某些病原体的抗性是适合使用基因组编辑技术的性状,因为难以在育种候选者中对性状进行无损检测,使用在整个作物基因组中簇集的CRISPR筛选的合理性建立了早期生活挑战模型的蜂窝电话并经常使用。

基因组编辑应用的不同类别包括:(i)发现影响感兴趣特征的单个或多个QTL的因果变异,以及随后通过编辑固定有利的等位基因; (ii)通过编辑其他种群,品系或物种的封闭繁殖系统中的有利等位基因进行基因渗入; (iii)创建和使用对感兴趣的性状有积极影响的从头等位基因。基因组编辑结合已建立的遗传和基因组方法,可以检测和预选候选功能变体,以进行体内下游验证和潜在的商业应用。

尽管几个突出的研究重点需要付出巨大的努力,但大多数水产养殖物种的高繁殖性能将使引入良好管理的育种计划种质中的潜在有利等位基因能够以不可行的规模和速率传播。陆生农场动物的生产。因此,在良好的监管和公众认知之下,基因组编辑技术具有通过水产养殖显着改变可持续海产品生产的潜力。


现在您已经阅读完了这篇文章...

…我们希望您会考虑支持我们的任务,即记录全球水产养殖业的发展,并每周分享我们广泛的,不断增加的贡献者知识的网络。

成为全球水产养殖联盟的成员,您可以确保我们通过成员的利益,资源和活动来开展所有竞争前的工作(学院, 倡导者,GAA电影,GOAL,MyGAA)可以继续。个人会员每年只需花费50美元。