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通过环境DNA预测养鱼场中的寄生虫暴发

吉安娜·巴斯托斯·戈麦斯(Giana Bastos Gomes)博士 凯特·赫特森(Kate S.Hutson)博士 何塞·多明戈斯 博士 钟凯瑟琳 斯科特·海沃德 特伦斯·米勒博士 院长R. Jerry教授

Barramundi案例研究证明了新型工具的潜力

环境DNA
从病原体定量环境DNA的方法为水产养殖生产经理和卫生专业人员提供了一种新颖而有效的工具来评估疾病暴发的风险。图为主要作者。

疾病是对水产养殖部门的重大影响,并成为其未来增长的主要制约因素之一。据报道,疾病约占水产养殖产量损失的40%(1,020亿美元)。因此,需要创新的方法来早期发现和管理水产养殖场的疾病暴发。环境DNA(eDNA)是与分子技术相关的一种采样方法,可以检测环境中存在的任何微生物或宏观生物的遗传物质。这种技术有可能改变水产养殖中病原体的检测和监测方式。

通过从水产养殖系统中收集水或土壤样品,环境DNA可以替代病原体的侵入性采样和定量分析。尽管传统的诊断方法(例如组织病理学,微生物学,PCR)仍然是确认动物传染病成因的金标准方法,但这些技术非常耗时。到农民从传统诊断测试中获得结果以控制暴发的时候。通过在感染动物之前检测水产养殖系统中的病原体,环境DNA方法提供了改善动物健康监测的机会。

在影响水产养殖业的不同病原体中,纤毛原生动物被认为是有鳍鱼类中一些最经济重要的寄生虫。通常,纤毛虫病暴发迅速发展,没有任何预警,导致死亡很快。 六叶草 是淡水有鳍鱼类系统中常见的纤毛虫,可以在寄生阶段和自由生存阶段之间交替变化,在2-3天内杀死鱼类。使用 C. hexasticha 作为模型有机体,对eDNA方法进行了测试,可以早期发现和量化金枪鱼或亚洲鲈鱼中的病原体(晚钙石 ) 农场。

注意:本文改编自原始出版物,并进行了总结( 水产养殖 479,2017 )。

澳洲肺鱼案例研究:采样和实验室处理

一年内每月从澳大利亚的一个商业淡水澳洲肺鱼养殖场的八个土池(约1.4公顷)中采集水样。使用单个塑料杯收集一式三份的15 mL池塘水样品,并将其倒入50 mL离心管中,该离心管中含有1.5 mL乙酸钠(3 M)和33.5 mL无水乙醇以保存DNA。将样品保存在冰上,直到在实验室进行处理。

使用直接的eDNA沉淀和提取方法处理样品,其中使用CTAB提取方案提取遗传物质。在同一时期,从受感染的肺鱼中收集到纤毛虫寄生细胞,用于物种鉴定和定量PCR(qPCR)分析的验证。开发qPCR测定法以鉴定 C. hexasticha 基于物种SSU-rDNA基因区域的水样本中的丰度(复制细胞/微升)。图1显示了从农场收集水到分子实验室加工的样品收集流程图。

环境DNA
图1:在詹姆斯库克大学分子实验室中从淡水尖吻鲈(Lates calcarifer)池塘(A)到qPCR分析(D,E,F)收集水的eDNA方法流程图(从A到F)。

此外,在农场监测的环境和生物学数据(溶解氧,温度,降雨量,鱼的体重和死亡率)与鱼的丰度有关。 C. hexasticha 水中的细胞拷贝数/微升(eDNA)。使用平均最高水温,最低溶解氧水平和每个池塘取水前连续5天的降雨量来测试水质参数与寄生虫丰度之间的关系。同样,使用每个池塘水取样后5天内记录的平均死鱼数量,测试了水中寄生虫丰度与鱼类死亡率之间的关系。

通过线性回归和相关性进行分析,以预测水取样后5天使用测量变量(即鱼的丰度)观察到的鱼死亡率 C. hexasticha (eDNA),降雨,溶解氧和水温以及鱼的重量),并评估观察到的任何环境变量是否可以预测鱼的丰度 C. hexasticha 在水样中。此外,主要成分分析(PCA)用于确定观察到的变量与池塘水中寄生虫细胞的丰度之间的关联。

结果与讨论

这项研究使用eDNA方法量化纤毛虫寄生虫的丰度 C. hexasticha 商业肺鱼养殖场水中的水(eDNA)含量,并研究其与水质和生产数据的关系。两者之间存在正相关关系 C. hexasticha 池塘水(eDNA)和鱼类死亡率(红色圆圈;象限I;图2)与鱼的体重(象限III;图2)和溶解氧水平(象限IV;图2)成反比。池塘水中的寄生虫数量(eDNA)与鱼类死亡率之间存在正相关,而与鱼类大小呈负相关,这进一步得到了证实。鱼死亡率与温水也呈正相关。换句话说,在所研究的农场中,较小的澳洲肺鱼特别容易受到水中纤毛虫寄生虫的高度影响,在雨季和温暖季节会发生死亡。

图2:主成分分析(PCA),显示以下相互之间的关系:澳洲肺鱼养殖水(eDNA)中的六头梭菌的丰度,鱼类死亡率,鱼的重量,降雨,溶解氧和2013/14年间采样池塘的平均温度。在收集eDNA前五天记录平均溶解氧和水温。在收集eDNA后五天记录平均鱼类死亡率。

有趣的是,丰度之间的同步 C. hexasticha 采样后五天观察到水中的细胞(eDNA)和观察到的鱼类死亡(图3)。水中寄生虫含量较高(eDNA)较高的月份中的样品,其鱼类死亡率也较高(图3)。高丰度 C. hexasticha 水和鱼体重中的细胞是鱼死亡率的重要预测指标,而较低的降雨和鱼体重则与鱼的高丰度显着相关。 C. hexasticha 水中的细胞。

事实证明,环境DNA是一种强大的方法,可用于预测鱼的死亡率,尤其是与农场记录的环境参数相关时。鉴于通常会在没有警告的情况下在养鱼场中造成致命的鱼类死亡,因此对水样中的寄生虫DNA进行定量分析为生产经理和卫生专业人员提供了一种新的有效工具,可以评估未来疾病暴发的风险。

图3:2013/14年间从澳大利亚淡水澳洲肺鱼养殖场收集的环境和生物学参数;水中梭状芽胞杆菌(eDNA)的平均含量(SE)和鱼类平均死亡率。

尽管eDNA方法在水产养殖中监测病原体是一个新的研究领域,但在商业条件下仍未充分挖掘其潜力。可以将环境DNA方法用作病原体采样的非侵入性技术,以最大程度地减少压力并改善水产养殖企业的动物福祉。

考虑到对水产养殖系统中微生物群落多样性的了解有限,eDNA代表了该行业释放水下秘密的新平台。更具体地讲,在水产养殖动物卫生部门内,eDNA提供了了解培养系统中病原体丰富和共感染的可能性。使用下一代高通量测序技术,可以开发一种单一的测定方法来鉴定农场和孵化场中多个水生群落的存在和丰度。

最后,可以使用便携式设备在农场上轻松进行eDNA,并将其作为常规工具纳入常规监测程序中,以评估未来疾病暴发的风险,从而使养鱼者能够迅速采取预防性健康管理和早期干预策略。