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益生菌福利太平洋白虾与AHPND挑战

Dang Thi Hoang Oanh,Ph.D. Mathias Cortel,Ph.D. 奥利维尔解放 ,Ph.D.

研究人员注意越南试验中的肝癌再生的更高存活和组织学症状

 益生菌
本研究表明,商业益生菌治疗对太平洋白虾具有有益效果,包括肝脏再生的较高存活和组织学症状。

 

早期死亡率综合征(EMS)是一种管理综合症。营养,生物安全,宿主生理学中的不利因素的组合,特别是微生物管理导致机会主义病原体如 颤音 Parahaemolyticus. 可以绽放并占据虾周围和内部的微生物群。当额外的毒力因子如胃和毒素产生的殖民殖民中加入到这种环境中时,疾病如急性肝病坏死(AHNPD)将导致严重损失。

在“传统”振动中的背景下,Inve Aquaculture已经在这个问题上致力于这个问题超过十年。因此,将我们已建立的亲和中的疗法治疗推断为这种新的变种是一种逻辑步骤 颤音 。在将我们的益生菌应用于现场时,作为整体干预议定书的一部分,大量的有益行动的经验数据 芽孢杆菌 收集了虾类文化期间的益生菌。在这项研究中,我们的目标是在受控实验室条件下测量Sanolife益生菌在标准化的AHPND挑战模型中的影响。

测试虾

太平洋白虾(Litopenaeus vannamei.)在水产养殖和渔业学院的虾孵化场和托儿所培育并护理,可以大学。虾股正在为WSSV,YHV(IQ2000 YHV / GAV)和AHPND VIBRIO进行监视,以维持SPF状态。

对于该研究,使用平均体重约为1克的PL20-25阶段的虾,在培养条件下受EMS / AHPND受影响最大的年龄和大小。在整个实验中使用天然海水,灭菌和稀释至25克/升,典型的盐度 P.Vannamei. 长出来。本研究最初在水产养殖亚太地区发表11(6):14-17。

细菌

我们指定本研究中使用的细菌菌株作为LTS14。它最初于2014年5月在越南诊断患有AHPND(Histo)病理学的虾分离,并储存在-80℃的TSB,补充有1.5%NaCl和25%的甘油。细菌被确定为 V. Parahaemolyticus.,通过TCBS的绿色菌落,常规API 20E生物化学测试和具有Lth引物的PCR。另外,分离物用AP3引物对PCR阳性。

在研究之前,LTS14的毒力广泛评估 体内 挑战,与其他菌株相比。挑战剂量是微调的,以获得可重复的子急性LD50-60 死亡率曲线(图1)。

图1:V.Vivo滴定的累积死亡率曲线V.Varahaemolyticus LTS14。将每种剂量施用于6个用10虾的重叠槽。基于该实验,由于其亚急性课程,选择了2×10 5 CFU ML-1的剂量进行进一步挑战。
图1:V.Vivo滴定的累积死亡率曲线V.Varahaemolyticus LTS14。将每种剂量施用于6个用10虾的重叠槽。基于该实验,2剂量为2×由于其亚急性课程,选择了105个CFU ML-1以进一步挑战。

挑战

在28℃下在补充有1.5%NaCl的TSB中生长细菌培养物。基于测定菌株的标准曲线,将细菌悬浮液在海水中稀释到对应于10的OD8 细胞ml. -1。在这种细菌培养物中浸入虾15分钟,连续通气,然后将两种细菌溶液和虾转移到含海水的水族水族馆,将细菌浓度降低至105 ,2 ×105, 106 ,2 ×106 细胞/ ml。在挑战后两天内没有水交换过水,每天20%的水每天都会延长。

实验设计

实验虾以每水族馆30个个体的密度储存,其中30升水,连续通气和水参数保持恒定在29±1°C,pH 7.7±2,NH3 <0.1毫克/升,每日水交换做4毫克/升。

比较以下五原的五份治疗方法:

治疗描述 挑战 V. Parahaemolyticus.
阴性对照(NC)
阳性控制(PC) +
抗生素控制(AB) 十豆素2g kg. -1 feed +
SanoLife Pro-2(Pro-2) 10g kg-1 feed +
SanoLife Pro-W(Pro-W) 5 mg l-1 +

 

饲料应用是彻底涂覆的每一次配油,每天一次加入水族动物的水处水。 SanoLife Pro-2的剂量为2×108 CFU. 芽孢杆菌 每G饲料和SanoLife Pro-W的剂量为2.5×105 CFU. 芽孢杆菌 每毫升水。除了NC,所有虾都挑战2×105 CFU. / ml LTS14,挑战后15天进行临床随访。

治疗的评价是基于统计学比较:(1)临床症状发病的严重程度和时间; (2)累积死亡率; (3)组织病理学分数的严重程度。

临床迹象的严重性AHPND

在挑战后24小时,在阳性对照组的75%的75%的75%以75%的75%观察到身体和肝脏和肝脏的临床症状。 AB和SanoLife Pro-W组中的虾还展示了AHPND症状,但厌食症较少,患有减少的动物(50%)。少于20%的虾接受SanoLife Pro-2被AHPND症状记录,并且在挑战后大幅延迟72小时。总标志的代表性照片如图2所示。

 ahpnd.
图2:挑战后48小时的总标志×105 CFU / ml V.帕拉莫溶解物LTS14。 (a)阴性对照(NC)虾,(b)阳性对照(PC)虾,(c)SanoLife Pro-2处理的虾。 AHPND的总迹象:在PC虾中可以清楚地注意到肠道内肠道,咽喉糊化和萎缩的饲料,可以清楚地注意到。疾病标志被延迟并减弱了SanoLife Pro-2处理的动物。

降低死亡率

死亡率在PC组1 DPI(接种后天数)开始,达到10天后的累积死亡率为52±10%(图3)。在AB和SanoLife Pro-W群中,死亡率也以1 dpi开始,累积死亡率分别达到32±12%和34±5%。 SanoLife Pro-2组注意到4天的死亡率延迟,累积死亡率在9天后停在17±3%。 SanoLife Pro-2结果统计上显着低于PC,但仍然高于NC 3±3%。

图3:挑战后治疗组的累积死亡率曲线2x105 CFU / ml V.帕拉莫溶解物LTS14。 NC:阴性对照,PC:阳性控制,AB:DOXYCYCLINE 2G / KG Feed,SanoLife Pro-2:10g / kg Feed,SanoLife Pro-W:5 mg / L饲养水。
图3:挑战后治疗组的累积死亡率曲线2×105 CFU / ml V.帕拉莫溶解物LTS14。 NC:阴性对照,PC:阳性控制,AB:DOXYCYCLINE 2G / KG Feed,SanoLife Pro-2:10g / kg Feed,SanoLife Pro-W:5 mg / L饲养水。

组织病理学

不同治疗中虾组织病理学分析的代表性图像。

组织学肝病
图4A:阴性对照:正常组织学肝病,具有分化的细胞类型,具有液泡的显着B细胞。
图4B:阳性对照(4 dpi):由于V.甲状腺素毒素(箭头)在坏死性小管中的V.甲状腺肿毒素上皮细胞的舍入和剥离,被厚的血细胞包封包围。
图4B:阳性对照(4 dpi):由于V.甲状腺素毒素(箭头)在坏死性小管中的V.甲状腺肿毒素上皮细胞的舍入和剥离,被厚的血细胞包封包围。
血细胞渗透
图4C:阳性对照(10 dpi):肝缺失周围的严重血液细胞浸润,将细胞从肝癌中脱落到胃中,结合细胞类型(B-,F和R细胞)。
肝脏上皮细胞
图4D:SanoLife Pro-2(10 dpi):偶像(箭头D2)观察到肝癌上皮细胞的舍入和剥离。与NC相比,上皮高度降低,但细胞型分化的损失不太明显(主要是B细胞)。血细胞浸润性较少,具有间质性的空间出现更纤维。

透视

为本研究开发和标准化的AHPND挑战模型导致阳性对照的死亡率曲线,其在几天后达到其最大值,并且不会擦掉所有接种的虾。这更符合虾农场的AHPND爆发,还提供了比使用不可行的高细菌浓度的许多据报道的挑战模型来评估可能的治疗干预措施的更好的机会。

我们的实验室研究结果表明,SanoLife Pro-2和SanoLife Pro-W益生菌治疗本身具有有益的效果,例如肝脏再生的更高存活和组织学症状。然而,类似于抗生素治疗,益生菌处理不足以完全保护虾氏疾病。为此,需要全面的方法,支持和纠正饲养系统和虾的健康状况。