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全面了解养殖虾的能力验证

费尔南多·阿朗格伦·卡罗博士 茉莉·米拉巴斯(Jasmine Millabas) Arun K.Dhar博士

亚利桑那大学为生产者进行可靠的疾病诊断

能力测试
由于对虾病原体的诊断是对虾产业的重要组成部分,因此可靠的诊断实验室是生物安全策略不可或缺的一部分,以确保全球对虾产业的可持续性。

基于传染病在全世界虾类行业中的重要性以及与虾类存在有关的问题,对虾病原体的诊断已成为这一正在发展的行业最关键的组成部分之一。对世界动物卫生组织(OIE)列出的任何疾病进行的特定诊断测试的阳性结果。可能对不同水平的虾类养殖产生重大影响:

在国家一级

对于OIE成员国,需要向该组织报告。即使有些国家没有及时向世界动物卫生组织报告,但在发生这种情况时,可能会导致一些贸易限制或其他要求,然后才从相应国家出口虾或虾产品。

在隔离级别

通常在进口活虾时进行检疫。作为该过程的一部分,在进口国对死/有症状的虾和活虾进行抽样以确认其卫生状况。当给定样品测试呈阳性时,将对相应的出口供应商/国家施加限制。

在亲鱼/孵化场一级

像其他任何动物生产行业一样,亲虾是虾产业的支柱。当给定的亲鱼/幼体样本对任何OIE列出的疾病呈阳性反应时,后果可能与消除整个亲鱼/幼体种群一样极端。

在成年池塘水平

取决于地方和区域生物安全战略,积极结果的后果可能导致紧急收成或人口消灭。

疾病诊断是生物安全成分的一部分

虾业生物安全的主要组成部分之一是疾病诊断分析,作为验证生物安全状况的一种手段,包括:

  • 了解有关疾病。
  • 确定需要排除的疾病/病原体清单。
  • 足够的诊断/检测方法。
  • 使用“干净”的虾苗。
  • 养殖种群的保证/监督。

这意味着拥有一个可靠的虾病原体诊断实验室是虾产业生物安全战略不可或缺的一部分。根据OIE手册,对虾病原体检测的首选诊断方法是聚合酶链反应(PCR)测试,这是一种分子生物学技术,可以跨多个数量级扩增DNA片段的单个或几个拷贝,从而产生许多(特定DNA序列的数千到数百万个拷贝。首选PCR技术有几个原因,包括:可用性,实用性和诊断特异性以及敏感性。在表1中,根据OIE手册2017对每种虾病原体的PCR信息进行了分组和汇总。

如表1所示,PCR是检测所有虾病原体以在所有阶段进行推定和确诊的首选方法。唯一的例外是在幼体阶段通过PCR检测WSSV,对此没有OIE推荐的方法。

Aranguren,PCR检测,表1

病原幼虫PL少年成人推定诊断确诊
禽流感病毒aaaaaa
WSSVdbaaaa
MBVaaaaaa
血压aaaaaa
HVaaaaaa
硅通孔aaaaaa
国际货币基金组织aaaaaa
AHPNDaaaaaa
NHPaaaaaa
表1. 世界动物卫生组织推荐用于虾病原体检测的PCR检测方法。该表改编自OIE手册2017。a =出于可用性,实用性和诊断特异性以及敏感性的原因,OIE推荐的方法; b =灵敏度高的标准方法&特异性c =由于成本或准确性而限制了应用的方法; d =不推荐使用的方法。
能力测试
图1:自首次参加以来,至少有两次参加PT的14个诊断实验室的虾病检测性能。红色表示相应实验室报告的至少一项假阳性/假阴性结果。蓝色表示报告疾病检测的准确性为100%。

能力测试或铃声测试(PT / RT)

能力测试
当诊断实验室继续参与PT时,它们往往会提高诊断准确性。

自2005年以来,亚利桑那大学水产养殖病理实验室(UAZ-APL;美国亚利桑那州)进行了水平测试(PT),也称为环测试(RT)。自那时以来,大约301个诊断实验室参加了PT,这帮助他们提高了通过PCR诊断虾病原体的能力。

根据多年来收集的数据,当实验室首次参加PT时,相应的诊断实验室通常会出现一些假阳性(+)或假阴性(-)结果的问题(图1)。但是,由于相同的实验室继续参与PT,因此它们往往会提高诊断准确性。图1显示了一些实验室最初参与PT的比较及其在随后的相同实验室参与过程中的进展。

从这些年来收集的数据中可以很清楚地看出,PT可以作为有助于提高诊断实验室疾病诊断准确性的指标。 UAZ-APL每年进行两次PT,具有以下功能:

  • 参与是自愿的。
  • 结果是机密的。
  • 没有针对特定疾病检测的规定方法。因此,参与实验室选择自己的检测方法。
  • 周期性:一年两次(2月和8月)。
  • 样品运输必须符合每个国家/地区的进口要求。
  • 提供了一组10个编码的样本,其中包含表2中列出的病原体的非感染性组织。
  • 参与实验室可以选择对一种或所有病原体进行检测。
  • 报告结果的标准化格式。结果必须包括引物组/商业试剂盒,提取方法,PCR条件,凝胶照片,扩增曲线和解链曲线等。
  • 返回结果的时间:参与实验室从收到样品之日起七个工作日。
  • 亚利桑那大学将结果报告给每个参与者,并根据需要提供建议以进一步提高疾病检测的准确性。

Aranguren,PCR检测,表2

病原世界动物卫生组织类别
白斑综合症病毒(WSSV)C1
陶拉综合症病毒C1
黄头病毒基因型1(YHV1)C1
传染性皮下和造血细胞坏死病毒(IHHNV)C3
传染性心肌坏死病毒(IMNV)C1, C2
坏死性肝胰腺炎(NHPB)C2
南美白对虾诺达病毒(PvNV)*没有C2, C3
副溶血性弧菌引起急性肝胰腺坏死疾病AHPND / EMS(VPAHPND)C1
肝小肠肠菌素(EHP)没有C2
不含特定病原体(SPF)不适用 不适用
表2.亚利桑那大学水产养殖病理实验室进行的PT中包括的虾病原体列表。 *在墨西哥,PT样品需要包含PvNV作为待测病原体的一部分。

自2005年以来,来自世界各地的多个诊断实验室都参加了PT。图2(面板a和b)显示了不同国家的疾病诊断实验室自2005年以来就参与了UAZ-APL的能力验证。2017年,来自15个国家的41个诊断实验室参加了PT。

图2:自2005年以来参加能力测试的诊断实验室和国家总数。

多年来收集的PT数据显示了虾病原体检测方法的发展趋势。图3显示了从终点PCR到实时PCR(qPCR)的PCR检测病原体的轨迹。收集的数据显示,2009年,不到10%的实验室使用qPCR进行病原体检测,2017年,超过50%的诊断实验室采用qPCR作为其标准方法进行病原体检测。

图3:通过PCR检测虾病原体的演变& 定量PCR.

如能力验证结果中所述,在虾病原体检测中遇到的常见问题

对参与实验室多年来报告的结果进行的审查和后续分析显示,参与实验室进行的PT相关的一些常见问题。下面列出的是我们在报告的结果中发现的一些常见问题:

样品切换

有时,参与实验室会正确执行样品处理。但是,在提交结果时,阳性样品的报告代码不同。另外,似乎在样品处理的第一步即核酸分离过程中,发生了样品交换。结果,原始样本现在被贴错了标签,显然样本的错误贴标签可能导致结果报告中的错误。

假阴性

我们多年来收集的数据清楚地表明,参与UAZ-APL开展的PT可以促进改善全世界虾类诊断实验室的性能。

这是由多种原因引起的,包括:

  • 反转录步骤不起作用。 当通过PCR检测RNA病原体时,这是一个普遍的问题。为了从RNA模板制备cDNA,使用了逆转录酶。逆转录酶是不耐热的酶。由于储存不当,该酶无法有效发挥作用或根本不起作用。如果这没有发生,则病原体的RNA基因组将不会被逆转录,PCR扩增将不会产生任何产物,从而导致假阴性。
  • 国际货币基金组织病毒,一种dsRNA病原体。对于这种特定病毒,在开始cDNA合成之前,需要执行其他步骤。煮沸样品以使RNA变性是cDNA合成的先决条件。如果RNA样品未煮沸,则会出现假阴性结果。
  • 高浓度DNA。当PCR中存在高浓度时,它可能会抑制扩增反应。在PCR和凝胶电泳后记录结果时,很容易注意到DNA的高浓度。在装载扩增DNA的孔中观察到DNA涂片,而不是离散的DNA条带。
  • 使用内部PCR方法。一些诊断实验室不使用任何OIE建议的程序。相反,他们使用内部开发的自己的PCR协议。有时这些程序没有经过优化和正确验证,导致无法扩增目标病原体。

假阳性

与误报相关的问题是由于以下原因引起的:

  • 采样过程中的交叉污染。由于样品中高的病毒/细菌载量,可能会发生交叉污染。
  • 巢式PCR。一些实验室使用嵌套式PCR进行某些病原体检测。在嵌套PCR步骤中,由于PCR设置过程中的移液误差和/或气溶胶形成,具有较高病原体负荷的阳性样品会污染后续的阴性样品。这些错误将导致交叉污染。
  • 与特定频段大小相似的非特定频段。由于缺乏适当的优化,某些PCR方案会导致DNA谱带的非特异性扩增,该DNA谱带与阳性对照的大小相似。一些实验室可能会将这些非特异性条带视为阳性。

观点

虾病原体的诊断是虾产业的重要组成部分。因此,可靠的诊断实验室必须是生物安全策略不可或缺的一部分,以确保全球虾类行业的可持续性。我们多年来收集的数据清楚地表明,由亚利桑那大学水产养殖病理实验室进行的PT可以促进改善全世界虾诊断实验室的性能。