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实时荧光定量PCR检测虾中的IHHNV

唐嘉 唐纳德·莱特纳(Donald V.Lightner)博士 罗宾斯·麦金托什

测试证实, 细角对虾 摄入受IHHNV感染的虾组织后32天无感染迹象

禽流感病毒
美国亚利桑那大学水产养殖病理实验室中使用的实时PCR仪。

许多研究工作都针对检测和定量养殖对虾中的病毒感染。分子技术已被证明非常有效,确定感染个体中病毒基因组的数量已成为监测虾类病毒性疾病进展的最重要手段之一。 

其他生物体中病毒载量的确定基于需要细胞培养的方法,但是尚未实现维持连续虾细胞培养的可靠方法。但是,美国亚利桑那州图森市的亚利桑那大学的研究人员开发了一种实时聚合酶链反应(PCR)方法,该方法可以定量单个虾中的病毒基因组,而无需进行细胞培养。 

实时PCR 

聚合酶链反应方法包括在5'核酸酶测定中添加TaqMan探针。在此应用中,TaqMan探针在5'末端标记有报告染料,在3'末端标记了淬灭染料。淬灭剂通过Forster共振能量转移抑制了报告分子发出的荧光。

在PCR期间,Taq聚合酶从其上游引物延伸出新的DNA。它的5'至3'核酸外切酶活性可从TaqMan探针上切割报告染料,该探针与模板DNA的内部杂交。这导致淬灭作用的破坏,随后荧光增加。 Taq聚合酶合成与TaqMan探针杂交的扩增子,从而使荧光量与生成的扩增子数量成正比。

实时PCR的主要功能是在每个循环中测量DNA扩增,与传统PCR相比,传统PCR可以测量循环完成后的累积扩增。另外,实时PCR测量荧光强度。这消除了PCR后的处理,大大提高了通量,并降低了污染的风险。

禽流感病毒 聚合酶链反应

禽流感病毒
图1:CsCl纯化的IHHNV和提取的IHHNV 脱氧核糖核酸的扩增图。

在开发针对传染性皮下和造血细胞坏死病毒的PCR检测方法的过程中,从IHHNV基因组的开放阅读框1中选择了一对PCR引物和TaqMan探针,以扩增一个81 bp的DNA片段。上游(IHHNV1608F)和下游(IHHNV1688R)引物序列分别为:5'-TAC TCC GGA CAC CCA ACC A-3'和5'-GGC TCT GGC AGC AAA GGT AA-3。 TaqMan探针的序列为:5'-ACC AGA CAT AGA GCT ACA ATC CTC GCC TAT TTG-3'。

引物和TaqMan探针均显示出对IHHNV特异,可用于从纯化的病毒体或感染IHHNV的虾中提取的DNA扩增IHHNV(图1)。

定量研究

为了确定IHHNV基因组的拷贝数,构建了包含靶IHHNV序列的质粒(称为pIHHNV-P4),并将其用作定量标准。质粒是环状的双链DNA单元,可独立于染色体DNA在细胞内复制。质粒最常见于细菌中,并用于重组DNA研究中以在细胞之间转移基因。

通过分光光度法测定pIHHNV-P4的浓度,并在IHHNV 聚合酶链反应分析中使用不同数量的质粒。该方法的检测极限为5个拷贝,线性范围最大为10亿个拷贝。

验证的结果

该测定法用于量化从墨西哥,关岛,菲律宾和伯利兹采集的受感染虾中的IHHNV,并从实验室攻击研究中定量。定量分析表明,野外捕获的大型少年 南美白对虾 1996年从墨西哥加利福尼亚湾收集的IHHNV自然感染了IHHNV,每微克DNA含有多达100亿个IHHNV拷贝。

在孵化场饲养的小型幼鱼中检测到相似数量的IHHNV 细角对虾 于1995年从关岛收集,并在农场饲养的后期幼虫(斑节对虾) 1996年从菲律宾进口。实验室感染 细角对虾 喂食受IHHNV感染的虾组织后31天,约含有十亿份IHHNV。

测试还证实了超级虾的样品®,一行 细角对虾 被选择为具有IHHNV抵抗力的动物,在摄取受IHHNV感染的虾组织后32天未显示感染迹象。在 南美白对虾 由于今年在伯利兹收集的矮小畸形综合症(RDS),发现了100亿份IHHNV(表1)。

唐,IHHNV的定量分析,表1

资源种类起源组织复制编号
微克1 脱氧核糖核酸
墨西哥细角对虾野抓ill1.1 x 109
千足动物4.2 x 108
关岛细角对虾孵化场1.2 x 109
菲律宾斑节对虾农场整个后幼虫1.6 x 109
墨西哥细角对虾实验室感染
第31天,送纸后
千足动物2.2 x 108
巴拿马细角对虾
(超级虾®)
实验室感染
第32天,送纸后
没有检测到
伯利兹南美白对虾农场千足动物4.5 x 109
表1.通过实时PCR对IHHNV进行定量分析。

 

伯利兹水产养殖有限公司已使用实时PCR来评估IHHNV 南美白对虾 显示RDS。从受RDS影响的池塘中选出10种虾,每种虾分别为三种规格(20、8和4克)。将每组的混合胸膜进行实时PCR分析。

结果显示,IHHNV的拷贝数因虾的大小而异。受RDS影响最小的虾的病毒载量最大(1 x 109份IHHNV),中等大小的虾具有中等载量(6.3 x 108),最大的虾具有最轻的病毒载量(4.4 x 107)。

根据这些结果,使用实时PCR分析来帮助从亲虾池塘中选择虾,该池塘中有来自受IHHNV感染的生产池塘的大型非矮虾。来自该池塘的大多数虾有107至109份IHHNV,但所测试亲虾的10%仅具有103至104份IHHNV。现在正在繁殖这些亲鱼以确定后代是否也具有较低的IHHNV水平,因此较少出现矮化畸形的趋势。

结论

实时PCR是一种实用技术,可以高特异性和高灵敏度快速定量分析大量样品。使用这种方法检测和定量对虾中的IHHNV已经揭示了有关IHHNV感染水平和病毒感染进展的新信息。

(编辑’注意:本文最初发表于2001年10月的 全球水产养殖倡导者


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