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研究朝着channel鱼中的Columnaris标准化挑战模型迈进

乔尔·巴德尔博士 肯尼斯·努斯鲍姆(Kenneth E.Nusbaum),DVM博士。

使用PCR可以从鱼组织中检测到少量

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养殖channel鱼经常感染 F.专栏 引起鞍背病变的细菌。

在商业生产的channel鱼中,柱状杆菌病是一个重大问题(马尾tal(Ictalurus punctatus)。归因于这种病原体的年度金钱损失仅次于因“ hole孔病”(of鱼的肠道败血症)而造成的金钱损失。柱状病的病原是 黄杆菌革兰氏阴性的长杆状细菌,在淡水环境中无处不在。通常,该细菌在channel鱼中引起鞍背病变。

需要可重现的挑战模型

在开发治疗或控制柱状病毒的手段上已经花费了大量时间和金钱,但是由于缺乏易于重现的细菌攻击模型而使科研人员无法比较测试结果和实验室之间的结果,因此大大阻碍了这些努力。这样的模型是建立疗效和最终政府批准任何治疗剂的前提。 

实验试验

为了帮助建立模型,美国农业部农业研究服务局位于阿拉巴马州奥本市的水生动物健康研究组的作者最近进行的试验评估了几种处理对病原体摄取和暴露于柱状病的鱼的敏感性的影响。 。 

磨损和细菌浸没

作者先前的研究表明, F.专栏 可以使用聚合酶链反应(PCR)直接从鱼类组织中检测细胞。在一系列实验中,PCR最初用于获得 F.专栏 细胞经过磨蚀并随后在细菌中浸泡后进入宿主鱼。 PCR和激发试验相结合的研究评估了四项试验-磨损和细菌激发,未磨损和细菌激发,磨损和假激发以及正常对照-每组三个重复。 

在细菌攻击或假攻击之后,对每种处理的30条鱼中的3条鱼进行五次采样。擦伤包括首先在单独的水槽中对鱼进行镇静,然后使用无菌干纱布对每条鱼进行物理擦伤。沿着每条鱼的左侧表面上的侧线来回拖动该布两次。深水挑战涉及将鱼浸入无菌细菌生长肉汤中。 

在研究的PCR采样部分之后的两周内每天记录激发后的死亡率,以确定累积的存活百分比。在研究过程中,在细菌或假细菌攻击后的零,五,十五,三十和六十分钟处死了三条鱼。使用无菌技术收集粘液,皮肤,血ill,躯干肾脏和肝脏的样本,并提取DNA。使用嵌套的物种特异性PCR分析这些模板DNA样品是否存在 F.专栏. 

经过测试的磨损方法

在另一系列实验中,评估了各种破坏上皮的技术使channel鱼易患柱状病的能力。评估的方法是物理磨损,酸灼伤,热烙印和冷烙印。所有方法均施用于鱼的左侧和右侧。 

冷烙涉及将一根电线放在干冰上20秒钟,而热烧灼将一根电线放在本生灯上20秒钟。烧酸涉及通过油漆刷施加0.1摩尔的氢氧化铵。 

将这4种处理方法和一个无鱼的对照鱼缸(每条鱼20条)浸入75升的水中,浸泡60分钟,每次1 x 108 每毫升24小时龄的菌落形成单位 F.专栏 在29±2摄氏度下生长。观察每个攻击罐在攻击后两周的死亡率。

组织病理学

在最后的一系列实验中,使用上述方法对20条cat鱼进行了研磨和攻击,并在攻击后四天监测死亡率。每个时间点分别在4、24、48、72和96小时从每个组中取5条鱼的组织病理学样本。这些样品储存在中性缓冲福尔马林中,包埋在石蜡中,并用苏木精和曙红染色。  

粘液置换

作为之前的一系列实验的一部分,在预处理之后,用芦荟衍生的“粘液替代”化合物处理了一组of鱼。对这一组进行了评估,以确定是否可以通过覆盖宿主皮肤来减轻预处理的影响。 

结果

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图1:一条未磨损的channel鱼的上皮和下层肌肉组织

通用的16S rRNA基因引物组可产生该基因预期的1,500 bp产物,而 F.专栏 物种特异性16S rRNA基因引物FvpF1-FvpR1产生了预期的1,193 bp产物。最早在攻击后五分钟就可以检测到来自外部组织来源的DNA模板中的细菌,并且可以在实验一小时前被检测到。 

研磨鱼和未研磨鱼在五分钟而不是一小时时对细菌的吸收差异显着。粘液,皮肤和g是早期检测出最可靠的组织 F.专栏. 

裸鱼的肝脏中细菌检测需要60分钟,而裸鱼的肝脏中细菌检测只需30分钟。相反,在未佩戴鱼的鱼中仅需五分钟即可检测到肾脏中的细菌,而在经过磨损的鱼中仅需60分钟即可检测到肾脏中的细菌。血液是唯一的磨损对检测时间有显着积极影响的组织,在磨损的鱼中五分钟后在未磨损的鱼中六十分钟后,细菌被细化。所有其他组织的磨损均未显着改变细菌检测。磨损挑战的累积存活百分比 F.专栏 磨损鱼的数量明显减少。

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图2:磨损四个小时后channel鱼的上皮和下层肌肉组织

与对照组鱼样本(图1)相比,随时间推移从from鱼身上进行的组织病理学样本具有物理磨损,酸烧伤,热烙印和冷烙印,表明其下皮上皮组织和肌肉组织发生了显着变化(图2和3)。在物理磨损和烧灼的cat鱼中观察到最大的变化。在处理后24小时,磨鱼的上皮表面显示出一些再生,并且在两天内几乎完全再生。

在本研究的细菌攻击部分,所有处理均增加了fish鱼对柱菌病的敏感性。观察到累积存活百分比为40%到60%,而对照no鱼没有记录到死亡率。 

磨蚀和热灼治疗的死亡率显着高于其他两种治疗。随着清除和攻击之间的间隔延长至三天,死亡率降低。与未处理的鱼相比,经过磨蚀或烧灼并用粘液替代物处理的challenge鱼在死亡之前显示了将近两天的死亡延迟(图4)。

结论

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图3:擦伤三天后channel鱼的上皮和下层肌肉组织上皮层的部分再生是明显的。

柱状鱼类最近的增加表明,cat鱼养殖业正在失去与这种疾病的斗争。为了打赢这场战斗,它必须确定发生柱状杆菌的条件,然后才能进一步控制病原体。例如,这些进展将使美国农业部农业研究服务局水生动物健康研究部门正在研发的活细菌疫苗更快速地得到测试。

在一段时间内,它和其他人的工作表明存在 F.专栏 仅凭其不足以引起临床疾病。实验室结果表明,获得的磨损和未磨损的cat鱼 F.专栏 在攻击后一个小时内检测所有组织然而,未磨损的鱼没有临床疾病的证据,而磨损的鱼表现出典型的鞍背病变并死亡。 

在一系列比较疾病因果模型的实验中,上皮的破坏似乎是疾病的主要前提,可以通过应用人工粘液剂来逆转。这组作者发现,使鱼类易患柱状病的最佳方法是物理磨损或烙印。两种方法在两天后均显示再生,表明快速上皮破坏比长期破坏或方法更为重要。 

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图4:人工粘泥替代对由于柱状病引起的channel鱼死亡率的影响。

在尚未发表的工作中,作者还观察到,在比较因处理或水质条件恶化而可能造成的伤害的模型时,感染的一个特征很明显:伤口或擦伤越大,越有能力进入细菌体内。鱼并引起疾病。但是,用人造粘液或减少剂量或数量来保护伤口 F.专栏 在水中显着降低鱼类的柱状菌发病率。这些发现为鱼类捕捞或运输后控制柱菌提供了重大希望。

(编辑’注意:本文最初发表于2003年8月的 全球水产养殖倡导者


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