微孢子虫 佩雷西亚 sp。和棉花虾病
通过组织病理学检测，以及新的原位杂交和PCR方法
从无脊椎动物到人类，微孢子虫是专一性的细胞内寄生虫。微孢子虫的研究更多地集中在陆地宿主上，但是已知的微孢子虫属中约有50％感染甲壳类和鱼类等水生宿主。这些水生宿主的微孢子虫感染被认为是潜在的健康危害以及水产养殖的财务风险。
影响对虾养殖的关键疾病之一是“对虾病”（CSD），与这种疾病相关的病原体是至少在五个属中发现的微孢子虫。 凤尾蕨, 特洛哈尼亚, 佩雷西亚, Agmasoma 和 阿梅森。这些微孢子虫寄生虫主要感染骨骼肌，使受影响的身体区域呈白色或不透明，这是该病的俗称。轻度感染的虾看起来和行为正常，但严重的感染使虾无法销售或不可食用。在虾中，肌肉的白色不透明外观主要与微孢子虫感染有关。但是，其他致病因素，例如鞭毛鞭毛藻，细菌或病毒，也可能与此疾病有关。
这项研究的重点是从马达加斯加，莫桑比克和沙特阿拉伯王国收集的虾中与CSD相关的微孢子虫。我们调查了其组织病理学特征，并通过小亚基rDNA（SSU rDNA）测序确定了其分类学分类。这些序列被广泛用于阐明生物之间的进化关系，因为它们具有悠久的渊源，并存在于所有已知的生命形式中。
同样，基于以下疾病开发了针对该疾病的特异性诊断方法：1.原位杂交[ISH;使用标记的互补DNA，RNA或修饰的核酸链（即探针）将特定DNA或RNA序列定位在组织的一部分或一部分中的一种杂交类型]； 2.聚合酶链反应（PCR），一种在分子生物学中广泛使用的方法，用于靶向SSU rDNA序列的多个DNA片段的拷贝。
研究设置
在过去的几年中，马达加斯加，莫桑比克和沙特阿拉伯共向298个显示CSD临床症状的虾样品提交给亚利桑那大学的水产养殖病理实验室。表1汇总了相关信息。
Han，CSD，表1
| 国家和物种 | 人生阶段 | 年级 | 目标器官 | 数量/总样本数 | 聚合酶链反应 |
|---|---|---|---|---|---|
| 马达加斯加（斑节对虾） | 成人 | G3-G4 | 肌肉 | 3/3 | 不适用 |
| 马达加斯加（斑节对虾） | 少年 | G3-G4 | 肌肉/ HP | 6/30 | 不适用 |
| 马达加斯加（斑节对虾） | 亚成人 | 不适用 | 肌肉/ HP | 不适用 | 位置 |
| 马达加斯加（斑节对虾） | 亚成人 | G3-G4 | 肌肉/ HP | 4/19 | 不适用 |
| 马达加斯加（斑节对虾） | 成人 | G2-G3 | 肌肉/ HP /心脏 | 3/5 | 不适用 |
| 马达加斯加（斑节对虾） | 亚成人 | G1-G3 | 肌肉/ HP | 6/28 | 不适用 |
| 马达加斯加（斑节对虾） | 少年 | 不适用 | 肌肉 | 不适用 | 位置 |
| 马达加斯加（斑节对虾） | 少年 | G3-G4 | 肌肉/ HP | 35/35 | 不适用 |
| 马达加斯加（斑节对虾） | 少年 | 不适用 | 肌肉/ HP | 不适用 | 位置 |
| 莫桑比克（斑节对虾） | 少年 | G3-G4 | 肌肉/ HP /腮/心脏/ LO | 4/23 | 不适用 |
| 莫桑比克（斑节对虾） | PL | G3-G4 | 肌肉/ HP /腮/心脏/ LO | 2/50 | 不适用 |
| 莫桑比克（斑节对虾） | 成人 | G3-G4 | 肌肉/ HP /腮/心脏/ LO | 4/4 | 不适用 |
| 沙特阿拉伯（P. indicus） | 成人 | G4 | 肌肉/ HP /腮/心脏/ LO | 3/3 | 不适用 |
| 沙特阿拉伯（P. indicus） | 成人 | G2-G4 | 肌肉/ HP | 30/93 | 不适用 |
| 沙特阿拉伯（P. indicus） | 成人 | 不适用 | 肌肉 | 不适用 | 位置 |
| 沙特阿拉伯（P. indicus） | 少年 | G2-G4 | 肌肉/ HP | 5/5 | 不适用 |
按照标准方法（Lightner，1996）对戴维森的酒精-甲醛-乙酸（AFA）固定样品进行处理，包埋在石蜡中并切成薄片（4 µm厚）。用苏木精和曙红染色后（H&E）或Giemsa，通过光学显微镜分析切片，并根据预先建立的G分级系统（来自Lightner，1996）对感染的严重程度进行分级。分级包括（G0），没有被病原体感染/侵染的迹象； （G1）存在病原体感染/侵染的迹象，但水平低于临床疾病所需的水平； （G2-G3）根据病原体引起的病变的数量和严重程度，出现中度至高度的感染和/或侵染迹象； （G4）具有高病原体数量的严重病变和晚期组织破坏。
结果与讨论
组织病理学检查
在虾和其他甲壳类动物中， 佩雷西亚 spp。破坏肌肉，并逐渐被大量的寄生虫发育阶段和孢子所取代。在感染的后期，寄生虫可能会侵入同一只虾中的其他组织和器官，例如触角腺的心肌细胞，上皮和结缔组织细胞。在这项研究中，同一只虾的几个组织受到这种微孢子虫的影响。组织病理学检查发现从马达加斯加，莫桑比克和沙特阿拉伯收集的样品中有许多微孢子虫孢子。感染主要影响肝胰腺和肌肉，严重程度对应于从G1到G4的等级。
在骨骼肌纤维中可见成熟的孢子（图1A，B），以及孢子前阶段和肝胰腺小管的孢子感染上皮（图1C，D）。在严重感染中，在g丝的上皮细胞（图1E，F），心肌纤维（图1G）和淋巴器官的实质细胞（图1H）中也观察到孢子。在感染的晚期，散布在整个生物体上的孢子可能源自肌肉感染：肌肉逐渐退化，孢子污染了周围的组织。此外，大多数CSD病例（90％）伴有由by引起的g污染疾病的感染。 t sp。要么 上sty sp。，这表明患有小孢子虫病的动物可能较弱，容易受到继发感染或侵扰。
引起CSD的新微孢子虫的SSU rDNA序列
我们在马达加斯加收集了具有CSD的对虾进行PCR靶向SSU rDNA序列，获得了一个1.2 kbp的片段并进行了测序。 SSU rDNA的核苷酸序列存放在Genbank中。根据测试结果，该核苷酸序列与SSU rDNA序列具有94％的同一性。 凤尾蕨 sp。感染 对虾和93％的身份不明的微孢子虫身份相同 木对虾。在2002年， 凤尾蕨 sp。从 set 被重新标识为 百日草 通过形态学检查。因此，基于序列信息，我们现在考虑新鉴定出的微孢子虫属 佩雷西亚，并将其称为 佩雷西亚 sp。此后。造成的CSD 佩雷西亚 sp。似乎遍布马达加斯加，莫桑比克，沙特阿拉伯（目前的研究），美国和日本等几个虾类养殖国家，但尚未对其进行充分的研究。
在这项研究中，从马达加斯加和沙特阿拉伯样品中提取的基因组DNA进行了针对SSU rDNA的特异性引物的PCR。对于两个样品，获得的序列是100％相同的。巧合的是，在这三个国家（马达加斯加，莫桑比克和沙特阿拉伯）检测到的白斑综合症病毒（WSSV）也显示出相同的基因组模式。
佩雷西亚 sp。 – 特定的ISH
探针对骨骼肌和肝胰脏（图2A-C）以及其他器官（例如腮，心脏和淋巴器官）均强烈反应（数据未显示），与组织病理学结果相对应。由SSU rDNA序列设计的探针。 佩雷西亚 sp。似乎特定于马达加斯加，莫桑比克和沙特阿拉伯的具有CSD症状的虾。
一开始，我们误认了 佩雷西亚 sp。通过正常的组织病理学检查将感染称为EHP感染。但是，此ISH探针对细角对虾 感染 肝大肠埃希菌 （图2D）。在无病原体制备的任何组织中均未见反应 南美白对虾。也 南美白对虾 和 斑节对虾 –以及感染了身份不明的多毛狗 Agmasoma样微孢子虫-对ISH探针无反应（数据未在此处提供）。
肝胰腺小管上皮细胞内 斑节对虾 来自马达加斯加。 （D）肝胰腺部分 细角对虾 来自文莱的被 肝小肠肠杆菌 显示出代表性的结果，强调了探针的特异性，如无深蓝色沉淀物所证实。染色：Bismark-Brown复染。比例尺= 30μm
佩雷西亚 sp。 – 特异性PCR
为了诊断目的，我们设计了一对靶向 佩雷西亚 sp。 DNA并生成一个443 bp的扩增子（分子生物学术语，表示一块DNA或RNA，是扩增或复制事件的来源和/或产物），如图3所示。该PCR反应对微孢子虫具有特异性 佩雷西亚 sp。会导致CSD，因此可能对监控此寄生虫有用。这些引物不与肝炎大肠埃希菌感染的虾的微孢子虫DNA反应（数据未显示）。此外，虾对基因组DNA也没有交叉反应（南美白对虾, 斑节对虾, 印度对虾, 细角对虾 和 罗氏沼虾），多毛et，鱿鱼和 卤虫 spp。 （数据未显示）。
我们没有通过PCR分析莫桑比克样品，但是该探针通过将反应产物沉积在莫桑比克样品的靶细胞中与ISH发生了强烈反应。在这项研究中，我们描述了来自马达加斯加，莫桑比克和沙特阿拉伯的红海-印度洋地区虾中引起CSD的肌肉和肝胰腺感染微孢子虫感染。
观点
通过组织病理学分析证实了小孢子虫感染，并将寄生虫鉴定为 佩雷西亚 sp。此外，我们开发了能够检测该寄生虫的ISH和PCR分析法。这些方法可以帮助虾生产者诊断和管理由微孢子虫引起的CSD 佩雷西亚 sp。
第一作者提供参考。
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作者
-
兽医学院水生生物医学实验室
庆北国立大学，大邱41566 -
兽医学院水生生物医学实验室
庆北国立大学，大邱41566 -
兽医学院水生生物医学实验室
庆北国立大学，大邱41566 -
阿瓜尔玛（AQUALMA），玛哈汉巴水产养殖
马达加斯加Mahajanga 401