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印度孵化器中Zoea-2综合征的研究,第1部分

严格的金马克 vidya. Sujeet Kumar博士 S.V博士。 alavandi. K.K.博士。 Vijayan.

概述和方法检查 太平洋白虾死亡

Zoea-2
印度虾孵化虫在Zoea-2阶段患有幼虫死亡率,莫尔特恶化并导致沉重的死亡率。

虾水产养殖 印度 是一个高度动态和快速增长的活动,由异国情调的太平洋白虾(Penaeus vannamei),2009年介绍。商业虾业的成功主要取决于健康和优质种子的可用性,276虾孵化器参与了特定病原体的生产(SPF) P.Vannamei. 种子和服务虾水产养殖部门。

由于越来越多的水产养殖部门的需求,在十年中,强化虾养殖基本上得到了改善。这种增长和商业化趋势具有加剧疾病的疾病。

疾病是虾幼虫育种系统的重大挑战,特别是细菌疾病,如发光细菌疾病,导致孵化场行动严重的经济后果。由于幼虫宫霉菌引起的,已经报道了鸡蛋和幼虫的大规模损失 legenidium. SPP。和 Sirolpidium. SPP。幼虫污染是由原生动物造成的 扎托地漩涡菌,除了其他病毒和细菌来源的疾病。

但是,自引入v以来Annamei.,印度虾孵化虫在Zoea-2阶段经历了幼虫死亡率,莫尔特恶化并导致沉重的死亡率。如果是 P.Vannamei. 在厄瓜多尔,墨西哥和美国的虾幼虫,幼虫损失被记录了“zoea-2 syndrome” in 1993.

在Zoeal阶段发生死亡率 P.Vannamei. 在印度虾孵化场中经常报道,考虑到生物和非生物因素的可能参与,为我们提供了全面调查问题的刺激。本文改编起 Aqua Cultura. (厄瓜多尔),2017年9月#119。我们承认钦奈癌症研究所电子显微镜传输部门的Pushpa Viswanathan教授,为Tamil Nadu和Andhra Pradesh的虾孵化场感谢虾孵化场为本研究的贡献样本和信息;并承认印度的国际动物登记委会(ICAR)进行财政支持,以执行这项工作。

我们调查了太平洋白虾的死亡率(Penaeus vannamei),在位于印度东海岸的15虾孵化场中的Zoea阶段。这种疾病,通常称为ZoEA-2综合征,其特征在于,由于其变态的变态,高度沉体,所以由于其变态的变态而降低了晚期Zoea-1和早期Zoea-2幼虫的饲养速度。微观研究揭示了受影响的幼虫的全身异常以及肝癌和肠道病理表现。微生物检测揭示了优势 vibrio alginyticus. 在大多数孵化场(九)受Zoea-2综合征影响。

Zoea-2
研究在位于印度东海岸的15虾孵化场中的Zoea阶段期间研究了太平洋白虾的死亡率。

除了上皮细胞分离和肠上皮的脱盐膜的脱裂之外,肝癌和肠道中的组织学检查揭示了真空化。 OIE(世界动物健康组织)聚合酶链反应(PCR)方案证实,受影响的幼虫中不存在OIE列出的虾病毒病原体。对肝癌和肠道病理表现的超微结构观察不能揭示病原体的存在。水质参数数据在正常范围内,并未似乎影响苗圃网站中的Zoea-2综合征的爆发。

饲养方案(用微藻 Skeletonema,Chaetoceros,Thalassia)在整个幼虫循环中均匀,也发现它们与Zoea-2综合征无关。肝癌和肠道的病理表现进一步表明消化和吸收能力的恶化,导致逐渐和渐进的方式延迟蜕皮和随后的幼虫死亡,在Zoea-2中累计死亡率为30%至100%阶段。还确定,在同一幼虫孵育单元中,Nauplii的连续储存3至4天加剧了九个受影响的苗圃(或48,IC 2.5-932.9)的发病率。 ZoeA综合征的病因(疾病原因)可能不是由于已知的传染性药剂,这是对我们研究的解释的另一种结果。

方法论:抽样和微生物检查 

该研究涉及沿着印度东部海岸的15个商业虾孵化场,包括泰米尔纳德邦(Kancheepuram和Vilupuram地区)和九个来自Andhra Pradesh(Nellore,Prakasham和East Godavari区)。在受动物综合征影响的幼虫循环下收集幼虫样品。在戴维森AFA固定剂中,在戴维森AFA固定剂中观察到活ZOEAS在达维拉德的样品下观察到组织学。在2.5%的戊二醛和0.1μmCacocylylate缓冲液中固定Zoeal样品,用于电子显微镜观察。幼虫也以90%的乙醇和大型乙醇(Ambion)保守用于通过PCR分析检测病原体。

zoea-2
从商业孵化器中收集虾幼虫的样品进行几次测试。

在微生物检查期间,收集0.5克幼虫的样品并置于无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液中,均质化并接种在硫代硫酸盐胆汁盐蔗糖(TCBS)琼脂和Zobell海洋琼脂(ZMA)上。通过10倍的连续板稀释平板在ZMA上重复进行总板数(TPC)。将平板在30±1摄氏度下孵育并在24小时后观察。基于表型特征,鉴定了主要型异养细菌菌群的纯培养。

DNA提取,RNA提取和cDNA合成

从幼虫样品中提取基因组DNA,如Rajendran等人的实验中所述。 (2016)。将幼虫样品在500μl裂解缓冲液(50mM Tris,1mM甲二氨基乙酸(EDTA),500mM NaCl1%SDS)和0.1mg蛋白酶K中以95℃-C均质化并在95摄氏度中均化10分钟。将混合物离心混合物在12,000 rpm以4摄氏度为10分钟。离心后,仔细收集上清液,加入两体积的乙醇并在Minu-20℃下保持一小时。然后将混合物在12,000rpm下以4℃离心10分钟。用70%的冷乙醇洗涤DNA沉积物,空气干燥,再悬浮在不含核酸酶的水中并储存在负-20摄氏度下。

在制造商的方案之后,使用Trizol™试剂从幼虫样品中提取RNA。使用纳米分光光度计评价提取的RNA的量和质量并储存在负-80度-c。根据制造商,使用10μL反应中的IScript cDNA合成试剂盒进行逆转录’S指令和cDNA在minus-20摄氏度下储存直至进一步使用。

检测病毒病原体  

使用核酸用于检测病毒病原体,通过PCR从幼虫样品中提取。对于检测白斑综合征病毒(WSSV),我们使用了嵌套的PCR协议。

其他DNA和RNA病毒 - 即,检测到皮下注射和造血传染性坏死(IHHNV),杆状病毒病毒(MBV),肝病病毒(HPV),黄头病毒(YHV),TAURA综合征病毒(TSV)和传染性肌属性(IMNV) - 由OIE推荐的PCR测试。隐蔽的死亡率综合征病毒(CMNV)通过巢式RT PCR协议进行测试,由Zhang等人描述。 (2014)。 PCR在热循环仪中进行。在用0.5μg/ ml溴化乙锭染色的2.0%琼脂糖 - 三乙酸乙酯-EDTA(TAE)凝胶上分解了扩增的PCR产物等分试样,并在UV照明下可视化扩增的DNA和100​​bp DNA的标记物使用凝胶文档系统(美国生物Rad Laboratories)。

光学显微镜检查

在光学显微镜下观察到在正常和受影响的幼虫循环的实际条件下收集的幼虫样品。对于组织学,Zoeal样品在Davidson AFA固定剂中固定48小时,并使用常规组织技术处理。将泻液样品通过分配醇(分别为70,90和100%)脱水60分钟。脱水后,将组织用二甲苯清除两次60分钟,用石蜡蜡进一步渗透2小时,然后使用Leica例如1160组织制备嵌段。在使用Leica RM 2145分子辊的石蜡块的清洁微观载玻片上获得组织切片4-5μm厚,并且随后通过苏木精和eosin染色的截面使用标准程序处理。将染色的组织切片安装在DPX上并在显微镜下观察。

电子传输显微镜

将幼虫样品在0.1M%的戊二醛(PH7.3)中固定在2.5%的戊二醛(pH7.3),在8摄氏度下固定在0.1%锇氧化锇中,使用相同的缓冲液在8摄氏度下2小时并加工根据Naveenkumar等人的协议。 (2013)。在加速80 kV电压下,在癌症研究所(WIA)Adyar,Chennai,在加速的80kV电压和显微照片中检查部分使用JEM 1400透射电子显微镜检查部分。

统计和流行病学分析

使用EPI INFO™7.1.2单表分析估计达到泰勒序列的95%的置信水平,估计疾病与风险因素之间关联与风险因素的关联强度的差距系数。 - 使用Fisher精确测试值。